DNA标签序列及测序文库构建方法和试剂盒技术

本发明专利技术涉及一种DNA标签，以及来5’末端连接有该DNA标签的PCR引物对，本发明专利技术还提供了由所述DNA标签和PCR引物对组成的构建测序文库的方法和试剂盒。本发明专利技术所提供的DNA标签与扩增引物形成一个特异性、灵敏度和重复性之间达到优化、平衡的检测产品，一次可以检测1-20个不同来源的样品，能够准确区分各种样本来源的碱基序列，本发明专利技术所述的高通量测序与测序法的吻合率高达100％。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体的是涉及一种DNA标签 序列及测序文库构建方法和试剂盒。 技术背景 DNA测序（DNA sequencing)作为一种重要的实验技术，在生物学研究中有着广泛 的应用。1977年Sanger专利技术了具有里程碑意义的末端终止测序法，Sanger法因为既简便 又快速，并经过后续的不断改良，成为了迄今为止DNA测序（即一代测序）的主流。一代测 序作为基因组研究的主要研究手段和金标准，在过去的几十年里取得了重大的成就，也使 得临床分子诊断成为了可能，但成本较高，耗时较长，通量低限制了其在临床的广泛应用。 随着人类基因组计划的完成，人们进入了后基因组时代，即功能基因组时代，传统的测序 方法已经不能满足深度测序和重复测序等大规模基因组测序的需求，对模式生物进行基 因组重测序以及对一些非模式生物的基因组测序，都需要费用更低、通量更高、速度更快的 测序技术，这促使了新一代DNA测序技术的诞生，第二代测序技术是相应于以Sanger测序 法为代表的第一代测序技术而得名。 第二代测序的基本原理是边合成边测序。在Sanger等测序方法的基础上，用不同 颜色的荧光标记四种不同的dNTP，当DNA聚合酶合成互补链时，每添加一种dNTP就会释放 出不同的荧光，根据捕捉的荧光信号并经过特定的计算机软件处理，从而获得待测DNA的 序列信息。二代测序是一项新的低成本，高通量，高准确度的快速测序技术，在临床和科学 研究方面都有着广泛的应用。 目前常用的测序方法根据影响力、测序原理等不同主要有以下几种：以 HeliScope TIRM和Pacific BiosciencesSMRT为代表的单分子测序，以454焦磷酸测序、 Illumina(Solexa)测序、ABI SOLiD测序为代表的二代高通量测序、DNA纳米球测序以及 2010 年Life Science公司推出的Ion Personal Genome Machine (PGM)测序等。 但目前二代测序所需的标签文库制备的方法存在着一些缺陷：现有测序平台的建 库步骤多且复杂，各个步骤都是独立制备的，需要分别进行纯化，以保证各个步骤之间不会 互相干扰和污染，从而造成DNA文库样品在纯化过程中不可避免的损失，操作过程繁琐。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是提供一种DNA标签，该DNA标签与PCR引物连接构成标签扩 增引物，通过PCR扩增使PCR产物带上相应的DNA标签，并通过将多个不同样品来源的带有 不同DNA标签的PCR产物混合成一个文库，从而实现高通量测序。 实现上述目的的技术方案如下。 -种DNA标签序列，包含至少一条以上序列，每条序列由6-8个碱基组成、且1) 标签序列中不含有3个以上碱基的重复序列；2)标签序列的GC含量在40%~60%之间； 3)标签序列与扩增引物组合成标签引物后，内部不存在发卡结构或二聚体等二级结构；4) 不同的标签序列之间不存在非特异性结合，5)标签序列中不含有与扩增引物相似度大于 80%的序列；6)标签引物之间不形成二聚体、不存在错配、与PCR产物之间均不存在非特异 性结合。 在其中一个实施例中，所述DNA标签序列，其选自SEQ ID N0:41-SEQ ID N0:60中 的至少一条。 在其中一个实施例中，所述DNA标签序列，其选自SEQ ID NO: 21-SEQ ID NO: 40中 的至少一条。 在其中一个实施例中，所述DNA标签序列，其选自SEQ ID NO: 1-SEQ ID NO: 20中 的至少一条。 本专利技术的另一目的是提供一种DNA标签构建测序文库的试剂盒。 实现上述目的的技术方案如下。 一种DNA标签构建测序文库的试剂盒，包括有：针对不同样品的不同引物组，每组 引物组包含有至少一对PCR引物对，且每对PCR引物对中至少一条的5'端连接有DNA标签 序列，所述同一引物组的DNA标签序列相同，不同引物组的DNA标签序列不同，所述DNA标 签序列如上所述。 在其中一个实施例中，PCR引物对选自SEQ ID N0:61和62, SEQ ID N0:63和64、 5￡〇10勵：65和66、5￡〇10勵：67和68。 本专利技术的另一目的是提供一种DNA标签构建测序文库的方法。 实现上述目的的技术方案如下。 -种DNA标签构建测序文库的方法，主要包括以下步骤： A、提取样本中的DNA ; B、采用上述DNA标签构建测序文库的试剂盒，用针对目标基因突变位点的标签 PCR引物，PCR扩增不同的待测样品，针对每种不同的待测样品的标签PCR引物中的DNA标 签序列不同； C、纯化回收PCR扩增产物，并将不同待测样品的扩增产物混合，构成核酸测序文 库。 在其中一个实施例中，所检测的样品的数量为1-20个，所述DNA标签序列选自SEQ 10勵:41-3￡〇10勵:60，或所述0嫩标签序列选自3￡〇10勵:21-3￡〇10勵:40，或所述 DNA 标签序列选自 SEQ ID N0:1-SEQ ID N0:20。 本专利技术的另一目的是提供一种高通量测序的方法。 实现上述目的的技术方案如下。 一种高通量测序的方法，主要包括以下步骤： A、采用上述的DNA标签构建测序文库的方法，建立核酸测序文库； B、将核酸测序文库依次进行末端修复、连接接头以及纯化回收连接产物； C、对上述连接产物进行测序，以确定所述核酸测序文库的序列信息。 在其中一个实施例中，所述步骤B中的所述接头的碱基序列如SEQ ID N0:69和 SEQ ID NO:70 所示。 本专利技术的主要优点在于： 1.本专利技术所设计的DNA标签序列具有非常好的特异性，DNA标签序列与扩增引物 组合成标签引物后，内部不存在发卡结构或二聚体等二级结构；不同的DNA标签序列之间 不存在非特异性结合，标签引物之间不形成二聚体、不存在错配、与PCR产物之间均不存在 非特异性结合。 2、本专利技术所提供的DNA标签与扩增引物形成一个特异性、灵敏度和重复性之间达 到优化、平衡的检测产品，一次可以检测1-20个不同来源的样品，能够准确区分各种样本 来源的碱基序列，与测序法的吻合率高达100%。 3.本专利技术的检测方法步骤简单，可通过一步PCR扩增即可完成一个样品中多种目 标检测序列的扩增，并使其扩增产物均带上一个特定的DNA标签，通过将带有不同标签的 不同样品PCR产物混合，实现一次检测多个样品多种PCR产物的并行检测，避免了反复多次 PCR等复杂操作过程中存在的诸多不确定因素，因而可大大提高检测准确率，体现了精确的 同时定性、定量分析特征。 4.本专利技术所提供的检测方法所需要的时间远远低于常用的测序技术，特别符合临 床需要。 5.本专利技术对第一代测序技术进行改进，使得所设计的DNA标签能适用于不同的检 测项目，具有很强的拓展性，同时，二代测序技术使得检测的灵敏度进一步得到提高，信噪 比增强，检测结果更加准确可靠。【具体实施方式】 为了能够更清楚地理解本专利技术的
技术实现思路
，特举以下实施例详细说明。应理解，这 些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。下列实施例中未注明具体条件的 实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册（New York:本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种DNA标签序列，其特征是，包含至少一条以上序列，每条序列由6‑8个碱基组成、且i)标签序列中不含有3个以上碱基的重复序列；ii)标签序列的GC含量在40％～60％之间；iii)标签序列与扩增引物组合成标签引物后，内部不存在发卡结构或二聚体等二级结构；iv)不同的标签序列之间不存在非特异性结合，v)标签序列中不含有与扩增引物相似度大于80％的序列；v i)标签引物之间不形成二聚体、不存在错配、与PCR产物之间均不存在非特异性结合。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：刘志明，吴诗扬，廖传荣，
申请(专利权)人：益善生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44