快速、安全地进行ＰＣＲ扩增的技术制造技术

本发明专利技术涉及从生物样品中快速、安全的鉴定病原体的方法。可以使用碘化树脂破坏病原体，同时将病原体ＤＮＡ保留在可分析的状态。ＤＮＡ随后可以用作ＰＣＲ分析的底物。这些碘化树脂的使用以比现有技术方法明显加快的方式工作，并允许科学家在生物安全３级（ＢＳＬ－３）条件下工作的时间最少。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及提取DNA以用于PCR扩增反应和其他分子生物学方法的新的广谱的快速制备方法。
技术介绍
聚合酶链式反应(PCR)提供了一种在需要或不需要提前培养生物体的情况下，增加目的序列拷贝数(扩增信号)的方法，因而，该方法允许增加检测在来自混合群体的具有DNA的样品中以少量存在的DNA序列的灵敏度(0u，C. Y.等人，Science 239 :292-295 ； Saiki, R. K.等人 Science 239 :487-494 ；Saiki, R. K.等人 Science 230 :1350-1354 ； Scharf，S. J.等人Science 233 :1076-1078)。该方法包括使DNA解链，并使短寡聚体引物退火至在目的序列侧面的区域。在游离的脱氧核苷酸存在的情况下，向混合物中加入DNA 聚合酶，并使DNA从引物延伸穿过目的区域。新的双链体又一次被解链，并重复这一过程。 这导致特定靶的指数累积，约为2n，其中η是解链和引物延伸的循环数。基因组单拷贝序列能够以高特异性扩增大于1000万倍。该方法通过使用从水生栖热菌(Thermus aquaticus) (Taq)中分离出来的热稳定聚合酶而得到改进，其避免了在每次解链循环后添加新的聚合酶的需要，并且已显示出具有高特异性。在微生物学领域和医学实践领域必需的一个方面是在属、种或血清型水平上确定地鉴定出微生物的能力。正确的鉴定不仅在实验室中是一个必要的手段，而且它也在食品加工过程、农产品的生产过程中和监测环境介质如地下水时对控制微生物的污染发挥显著作用。应用于微生物污染的规定的严格性增加已导致必需专用于污染监控的工业资源相应地增加。由于具有鉴定微生物和检测病毒DNA的能力，PCR在检测和诊断疾病中的作用越来越重要。例如，Weiburg等(EP517361)公开了一种包括PCR扩增大肠杆菌(E. coli)的 DNA用于检测和鉴定病原微生物的方法。细菌和病毒DNA的检测在许多疾病的治疗中都有很大的帮助。因此，在现在的医学领域，对于医生或其他医学人员重要的是快速、准确地检测与患者有关的生物液体或其他液体中的病原微生物。在进行PCR之前，首先必需对样品中的DNA(或RNA)进行纯化。纯化DNA需要进行提取步骤，其一般涉及破坏待分析样品的细胞膜，使细胞内的蛋白变性以及将DNA从变性的蛋白质和其他细胞组分中分离出来。对于临床医生和法医科学家可用的DNA提取技术既耗时，又费力，通常需要进行多个步骤并且使用危险试剂。传统的DNA提取技术包括密度梯度离心，有机溶剂沉淀和/或盐沉淀。除了上述问题，这些技术还会增加样品之间交叉污染的风险。与DNA提取和纯化相关的问题已引起了设计为提高效率和安全性的新方法。固相提取方法，如美国专利5234809和美国专利7238530所公开的那些方法，已经被用于纯化包括DNA和RNA在内的核酸分子。该方法包括裂解细胞，将释放的DNA结合到固相支持物上， 洗去杂质以及提取纯化的DNA。优选的裂解剂是离液剂硫氰酸胍和盐酸胍。固相支持物优选硅颗粒。尽管该方法旨在简化样品的处理过程，但其仍然是微生物特异性的并且仍然需要多个实验步骤。此外，DNA的提取方法需要使用高浓度的有毒试剂。也设计了液相方法用于简化DNA的提取方法。一种此类方法需要使用螯合树脂 Chelex 100，一种含有成对的亚氨基二乙酸盐的苯乙烯-二乙烯基苯共聚物。这种树脂能够清除金属污染物(如镁)，而这些金属污染物催化核酸的降解。此外，Chelex. 100能够破坏细胞膜并使DNA变性。在实践中，将样品溶于蛋白酶K存在下的水中并于55°C孵育溶液约1个小时。接着将混合物加热至100°C的温度另外进行15分钟。然后将混合物漩涡振荡并且离心。变性后的蛋白和金属离子沉淀到管底部。来自上清液的等分物(aliquot)可用于进行PCR。需要注意的是这种方法需要多个操作过程，复杂的人为干预，并且要加热到 100°C，这些增加了处理时间和处理过程的危险，尤其是当使用危险的致病性材料操作时。 另外，并不是所有类型的样品都适用于该方法操作。还需要注意的是，市场上的大多数试剂盒所提供的是制备非致病性样品的有限的装置(means)，这迫使分析者在具有生物危险的条件下进行PCR实验。这带来了重大的安全问题，而这些问题在本领域中并没有得到充分的解决。这样，研究者可能需要在生物安全3 级或4级(BSL-3或BSL-4)的实验室来进行实验，这进一步增加了处理时间。因此，需要发展简化的、更加快捷和低危险性的方法来分析生物样品。尤其是需要发展更快、更安全和更经济的方法来分析致病性样品。方法必须能够快速、高效地使病原体失活，同时保持待扩增和分析的核酸(如DNA)的完整性。此外，简化的方法允许在偏远的小型诊所和医务中心使用并不昂贵的PCR设备，这将有助于医务工作者获得快速、确定的诊断结果，以便于治疗他们的患者。专利技术概述本专利技术提供了非常快速、简便的(一步)裂解液体样品(如血液、唾液、尿液或其他)中细胞的方法，该方法的目的在于从样品中发现的病原体中提取核酸(如DNA或者 RNA)，同时为实验室工作者提供了不需要使用复杂设备如加热设备或超声设备就能进行处理的无生物危险的样品。所述DNA能作为PCR或者其他微生物方法的底物，这引起病原体的快速扩增和鉴定，同时破坏可能的(in question)病原体的活性。在本专利技术的一个方面中，使用碘化树脂作为活性剂来裂解含有病原体(如病毒或细菌)的液体样品中的细胞，并且破坏病原体的致病能力。接着用PCR方法对来自裂解细胞的核酸进行扩增和鉴定。碘化树脂不会对DNA的完整性产生负面影响，因此，PCR的性能和灵敏度都是最优化的。本专利技术的一个方面是分析生物样品的方法，其包括以下步骤提供含有病原体的液体样品，将该液体样品与碘化树脂相接触，将碘化树脂从液体中分离出来和通过分析技术确定病原体身份(identity)。本专利技术的另一个方面是分析生物样品的诊断试剂盒，其包括以下步骤提供含有病原体的液体样品，将该液体样品与碘化树脂相接触，将碘化树脂从液体中分离出来和通过分析技术确定病原体身份。本专利技术的另一个方面是包含碘化树脂的前-PCR诊断试剂盒，所述试剂盒允许省去加热和/或冷却和/或超声步骤和设备。专利技术详述本专利技术提供了分离病原样品的DNA的快速、安全的方法，所述DNA用于PCR或者其他的微生物方法。该方法包括使用需求的(demand)消毒剂碘化树脂作为活性剂来裂解细菌的细胞膜或病毒的保护性外壳，由此从病原体中将核酸物质移出。碘化树脂破坏病原体的毒性效应，同时保持所述病原体的DNA。令人惊奇的，已发现新的技术显著地减少了实验步骤的数目、时间和用PCR分析生物样品所需要的劳动力，同时破坏可能的微生物的致病性。碘化树脂已被建议用作需求的消毒剂，命名为消毒剂，其中碘基于按需作用 (demand-action)被几乎完全释放。碘化树脂(“^^0#11”树脂)，如美国专利5639453 (‘452 专利)所公开的那种，可用于增强裂解作用和破坏微生物的致病性而不对PCR过程产生负面影响。‘452专利的内容被全部引入本文作为参考。Triosyn样品(珠子，片段，粉末)全部都包含三碘化物分子，其是本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种分析生物样品的方法，其包括以下步骤：（ａ）提供含有病原体的液体样品，（ｂ）将所述液体样品与碘化树脂接触，（ｃ）将所述碘化树脂从所述液体中分离出来，和（ｄ）通过分析技术来确定病原体的身份。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：皮埃尔·J·梅西尔，
申请(专利权)人：安全生活特莱奥辛公司，
类型：发明
国别省市：US