蓝莓RNA的提取方法技术

本发明专利技术公开了一种蓝莓RNA的提取方法，该方法为：1)将蓝莓组织研磨成蓝莓粉末，将蓝莓粉末与抽提溶剂中混合并孵育得到孵育混合液；2)将孵育混合液进行抽提处理得到抽提上清液；3)将抽提上清液与氯化锂溶液混合，静置过夜、离心处理得到总RNA沉淀；4)将总RNA沉淀溶解于DEPC处理的超纯水中，接着于氯仿/异戊醇混合液中进行抽提处理，进行离心处理以得离心上清液；5)将离心上清液与醋酸钠溶液混合，加异丙醇进行静置处理，离心处理得到沉淀物；6)将沉淀物通过乙醇溶液进行清洗得到清洁沉淀物；7)将清洁沉淀物敞口放置，加DEPC处理的超纯水得到蓝莓RNA。通过该方法能够提取纯度优异的蓝莓RNA且提取率高。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及RNA的提取方法，具体地，涉及蓝莓RNA的提取方法。
技术介绍
蓝莓(Vaccinium spp.)为杜鹃花科越橘属灌木果树。蓝莓果实被联合国卫生组织列为最佳营养价值的水果，同时被美国评为世界十大健脑食品，被国际粮农组织列为人类五大健康食品之一。所以蓝莓的社会需求量日益增长，各国相继引种栽培。2009年以来我国蓝莓产业出现快速发展，目前主要分布于五大区域：长白山及大小兴安岭地区、辽东半岛、胶东半岛、长江流域、云贵川及华南地区。随着栽培面积和产量的不断上升，相关应用研究及应用基础研究越来越受到关注。转录组学在其他园艺作物上开展较多，但在蓝莓上的研究极少。蓝莓果实及叶片等组织器官中，花青素等次生代谢物含量相对较高，采用常规的RNA提取方法(包括RNA提取试剂盒)不容易获得成功，这成为后续转录组学研究的瓶颈。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种蓝莓RNA的提取方法，通过该方法能够提取纯度优异的蓝莓RNA且提取率高。为了实现上述目的，本专利技术提供了一种蓝莓RNA的提取方法，该提取方法包括：1)先将蓝莓组织在液氮的存在下研磨成蓝莓粉末，再将蓝莓粉末与抽提溶剂中混合并孵育以得到孵育混合液；2)将孵育混合液于氯仿/异戊醇混合液中进行抽提处理以得到抽提上清液；3)将抽提上清液与氯化锂溶液混合，接着进行静置过夜处理，然后进行离心处理以得到总RNA沉淀；4)将总RNA沉淀溶解于DEPC(焦碳酸二乙酯)处理的超纯水中，接着于氯仿/异戊醇混合液中进行抽提处理，然后进行离心处理以得到离心上清液；5)将离心上清液与醋酸钠溶液混合，接着加入异丙醇，然后进行静置处理，最后进行离心处理以得到沉淀物；6)将沉淀物通过乙醇溶液进行清洗以得到清洁沉淀物；7)将清洁沉淀物敞口放置，然后加入DEPC处理的超纯水以得到蓝莓RNA；其中，抽提溶剂含有CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)抽提液与β-巯基乙醇；于氯仿/异戊醇混合液中进行抽提处理为：将待抽提物与氯仿/异戊醇混合液混合，接着进行冰浴，最后进行离心处理取上清液；乙醇溶液的清洗为：将待清洗物溶于乙醇溶液中，然后离心处理取下层沉淀。通过上述技术方案，本专利技术通过上述各步骤的协同作用，从而成功地从蓝莓材料中提取出了蓝莓RNA；并且，该提取方法简便易行，进而满足了后续转录组测序及相关研究的要求。同时，该提取方法的提取率较高。本专利技术的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。附图说明附图是用来提供对本专利技术的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本专利技术，但并不构成对本专利技术的限制。在附图中：图1是检测例1中检测样品指标图；图2是检测例1中检测样品的琼脂糖凝胶电泳检测结果图；图3是检测例1中样品WGC055871的芯片生物分析仪的检测结果图；图4是检测例1中样品WGC055872的芯片生物分析仪的检测结果图；图5是检测例1中样品WGC055873的芯片生物分析仪的检测结果图；图6是检测例1中样品WGC055874的芯片生物分析仪的检测结果图。具体实施方式以下对本专利技术的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本专利技术，并不用于限制本专利技术。本专利技术提供了一种蓝莓RNA的提取方法，该提取方法包括：1)先将蓝莓组织在液氮的存在下研磨成蓝莓粉末，再将蓝莓粉末与抽提溶剂中混合并孵育以得到孵育混合液；2)将孵育混合液于氯仿/异戊醇混合液中进行抽提处理以得到抽提上清液；3)将抽提上清液与氯化锂溶液混合，接着进行静置过夜处理，然后进行离心处理以得到总RNA沉淀；4)将总RNA沉淀溶解于DEPC处理的超纯水中，接着于氯仿/异戊醇混合液中进行抽提处理，然后进行离心处理以得到离心上清液；5)将离心上清液与醋酸钠溶液混合，接着加入异丙醇，然后进行静置处理，最后进行离心处理以得到沉淀物；6)将沉淀物通过乙醇溶液进行清洗以得到清洁沉淀物；7)将清洁沉淀物敞口放置，然后加入DEPC处理的超纯水以得到蓝莓RNA；其中，抽提溶剂含有CTAB抽提液与β-巯基乙醇；于氯仿/异戊醇混合
液中进行抽提处理为：将待抽提物与氯仿/异戊醇混合液混合，接着进行冰浴，最后进行离心处理取上清液；乙醇溶液的清洗为：将待清洗物溶于乙醇溶液中，然后离心处理取下层沉淀。在本专利技术中，抽提溶剂的组分含量可以在宽的范围内选择，但是为了能够进一步提高RNA的提取率，优选地，在抽提溶剂中，CTAB抽提液与β-巯基乙醇的体积比为100：1-2；其中，CTAB抽提液具体组成也可以在宽的范围内选择，但是为了进一步提高RNA的提取率，更优选地，CTAB抽提液含有1.8-2.2重量比％的CTAB、95-105mM的Tris-HCl缓冲溶液、1.8-2.2mol/L的NaCl、22-28mmol/L的EDTA-Na2和DEPC处理的超纯水。另外，抽提溶剂可以是提前配置好备用，该抽提溶剂可以在3-5℃下保存一天，但是为了防止抽提溶剂变质，优选现配现用。同时，在本专利技术中，氯仿/异戊醇混合液中的各组分的用量可以在宽的范围内选择，但是为了能够进一步提高RNA的提取率，优选地，在氯仿/异戊醇混合液中，氯仿与异戊醇的体积比为22-26：1。另外，在抽提处理中，氯仿/异戊醇混合液的用量可以在宽的范围内选择，但是为了提高RNA的提取率，优选地，相对于750μL待抽提物，氯仿/异戊醇混合液的用量为700-800μL。同时，在抽提处理中，冰浴条件也可以在宽的范围内选择，但是为了提高RNA的提取率，更优选地，冰浴至少满足以下条件：冰浴温度为-25～-15℃，冰浴时间为8-12min。在上述方法的步骤1)中，抽提溶剂的温度、混合的时间以及孵育的具体条件均可以在宽的范围内选择，但是为了进一步提高RNA的提取率，优选地，在步骤1)中，抽提溶剂的温度为63-68℃，混合的时间不小于30s，孵育至少满足以下条件：孵育温度为63-68℃，孵育时间为8-12min。此外，在上述方法的步骤1)中，CTAB抽提液与蓝莓粉末的具体用量可以在宽的范围内选择，但是为了提高RNA的提取率，优选地，相对于
750μL的CTAB抽提液，蓝莓粉末的用量为80-110mg。这是由于，蓝莓粉末太多会降低裂解效果，影响最终结果。但是对于果实等RNA含量较低的材料，应按比例增加样品和抽提液用量。在本专利技术中，步骤2)中的抽提处理的次数可以在宽的范围内变化，但是为了提高提高RNA的提取率，优选地，在步骤2)中，抽提处理的次数为2-3次。在本专利技术的步骤3)中，抽提上清液与氯化锂溶液的体积比可以在宽的范围内选择，但是为了提高提高RNA的提取率，优选地，在步骤3)中，抽提上清液与氯化锂溶液的体积比为3-5：1。在本专利技术的步骤3)中，静置过夜处理的具体条件可以在宽的范围内选择，但是为了提高提高RNA的提取率，优选地，静置过夜处理至少满足以下条件：于3-5℃下静置8-16h或者于-22～-18℃下静置6h以上。在本专利技术的步骤3)中，氯化锂溶液的浓度可以在宽的范围内选择，但是为了提高提高RNA的提取率，优选地，氯化锂溶液的浓度为8-12mol/L。在本专利技术的步骤4)中，DEPC处理的超纯水与总RNA沉淀的用量可以在宽的范围内选本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种蓝莓RNA的提取方法，其特征在于，所述提取方法包括：1)先将蓝莓组织在液氮的存在下研磨成蓝莓粉末，再将所述蓝莓粉末与抽提溶剂中混合并孵育以得到孵育混合液；2)将孵育混合液于氯仿/异戊醇混合液中进行抽提处理以得到抽提上清液；3)将所述抽提上清液与氯化锂溶液混合，接着进行静置过夜处理，然后进行离心处理以得到总RNA沉淀；4)将所述总RNA沉淀溶解于DEPC处理的超纯水中，接着于氯仿/异戊醇混合液中进行抽提处理，然后进行离心处理以得到离心上清液；5)将所述离心上清液与醋酸钠溶液混合，接着加入异丙醇，然后进行静置处理，最后进行离心处理以得到沉淀物；6)将所述沉淀物通过乙醇溶液进行清洗以得到清洁沉淀物；7)将所述清洁沉淀物敞口放置，然后加入DEPC处理的超纯水以得到蓝莓RNA；其中，抽提溶剂含有CTAB抽提液与β‑巯基乙醇；所述于氯仿/异戊醇混合液中进行抽提处理为：将待抽提物与氯仿/异戊醇混合液混合，接着进行冰浴，最后进行离心处理取上清液；所述乙醇溶液的清洗为：将待清洗物溶于乙醇溶液中，然后离心处理取下层沉淀。

【技术特征摘要】
1.一种蓝莓RNA的提取方法，其特征在于，所述提取方法包括：1)先将蓝莓组织在液氮的存在下研磨成蓝莓粉末，再将所述蓝莓粉末与抽提溶剂中混合并孵育以得到孵育混合液；2)将孵育混合液于氯仿/异戊醇混合液中进行抽提处理以得到抽提上清液；3)将所述抽提上清液与氯化锂溶液混合，接着进行静置过夜处理，然后进行离心处理以得到总RNA沉淀；4)将所述总RNA沉淀溶解于DEPC处理的超纯水中，接着于氯仿/异戊醇混合液中进行抽提处理，然后进行离心处理以得到离心上清液；5)将所述离心上清液与醋酸钠溶液混合，接着加入异丙醇，然后进行静置处理，最后进行离心处理以得到沉淀物；6)将所述沉淀物通过乙醇溶液进行清洗以得到清洁沉淀物；7)将所述清洁沉淀物敞口放置，然后加入DEPC处理的超纯水以得到蓝莓RNA；其中，抽提溶剂含有CTAB抽提液与β-巯基乙醇；所述于氯仿/异戊醇混合液中进行抽提处理为：将待抽提物与氯仿/异戊醇混合液混合，接着进行冰浴，最后进行离心处理取上清液；所述乙醇溶液的清洗为：将待清洗物溶于乙醇溶液中，然后离心处理取下层沉淀。2.根据权利要求1所述的提取方法，其中，在所述抽提溶剂中，所述CTAB抽提液与β-巯基乙醇的体积比为100：1-2，在所述氯仿/异戊醇混合液中，氯仿与异戊醇的体积比为22-26：1；优选地，所述CTAB抽提液含有1.8-2.2重量比％的CTAB、95-105mM的Tris-HCl缓冲溶液、1.8-2.2mol/L的NaCl、22-28mmol/L的EDTA-Na2和所述DEPC处理的超纯水；在所述抽提处理中，相对于750μL所述待抽提物，所述氯仿/异戊醇混合液的用量为700-800μL；所述冰浴至少满足以下条件：冰浴温度为-25～-15℃，冰浴时间为8-12min。3.根据权利要求1或2所述的提取方法，其中，在步骤1)中，所述抽提溶剂的温度为63-68℃，所述混合的时间...

【专利技术属性】
技术研发人员：肖家欣，许庆龙，高轩，樊基胜，张春龙，李晴晴，鲁珊珊，
申请(专利权)人：安徽师范大学，
类型：发明
国别省市：安徽;34