样品制备方法和设备技术

一种具有靶标富集的制备核酸样品的方法，采用反应容器(11)，其中向样品加入螯合剂并加热至约99℃以提供粗裂解物。提供PNA探针，浓度足以结合和捕获可识别水平的靶核酸。PNA探针可附着珠(26)，珠(26)初始包埋于蜡主体(17)并在加热期间释放，从而其自由移动并接触PNA探针和靶DNA。结合发生后，所述珠沿着蜡(17)磁性吸引回口袋(16)中，蜡(17)能在移出反应容器前凝固。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】引言本专利技术涉及制备用于分析的样品，如组织或血液样品，或有核酸(NA)(如DNA或RNA)的任何其它样品。从样品分离和纯化感兴趣NA是在法医学、食品安全、医学等领域的分子生物应用中的关键步骤。样品裂解和全核酸提取技术通常是复杂的、耗时、需要技术人员或机器人、需要昂贵的消耗品和增加交叉污染的风险。复杂性对人工和自动系统等构成问题，相似地，越简单系统越稳健。当提取自较大量样品时，盐的共沉淀(其可抑制下游化学反应)和玻璃微纤滤器的NA过载是常见问题。过量DNA能抑制PCR，因为隔绝了扩增所需要的Mg2+。这限制可用的总NA提取的量，当提取物中的靶DNA相对稀少时这比较麻烦。总NA提取对于大部分基因检测而言不必要。纯化感兴趣序列会在许多情况下优选。另外，许多技术效果好(PCR)或甚至需要更短的NA模板(如下一代测序)。多个液体处理步骤能导致不同DNA或RNA损失或提取效率不均匀。μRNA由于表达变化而在早期疾病鉴定中变得更重要，然而μRNA特异性试剂盒昂贵，且因为尺寸小(18-24bp)，μRNA可能在许多提取技术中丧失。Poly(T)探针有时用于从总RNA提取中选择性捕获信使RNA(mRNA)。然后，富集的mRNA部分可进行测序以分析不同基因的相对表达(外显子组分析)。此表达概况包含有价值的信息以用于农业和医疗诊断，或组织培养物对新药物疗法的反应。然而，mRNA仅为1-5％的总RNA(～80％是核糖体RNA)，且现有提取方法易导致稀有材料损失或改变不同序列的相对频率。另外，RNA特别容易受破坏，通常通过普遍存在的环境RNase。简单快速提取感兴趣的靶NA(尤其是稀有或脆弱种类如mRNA)会提高下游分析的质量。最后，现有靶向mRNA的试剂盒一般昂贵(每样品大于€25)。鉴于遗传分析技术的发展，这类样品制备成本是使这些技术可用于工业和医疗部门用户的一大障碍。US2003/0059789(Efimov等)描述寡核苷酸类似物、合成方法和使用方
法。其在靶标富集中使用PNA。US2004/0161788(Chen等)描述有3个区段的样品处理管。其看来描述复杂的多试剂步骤、多室和多阀门系统。提及螯合剂，即EDTA。这显然作为一些示例中的抗凝剂，而另一些示例中于靶标富集期间在DNA提取后使用。Michele K.Nishiguchi等：“DNA分离程序(DNA Isolation Procedures)”2002年1月1日，Birkhauser Basel,Basel ISBN 978-3-03-488125-8第249-287页描述多种DNA分离程序。这教授数种DNA分离方法，包括向样品加入含ChelexTM和EDTA即2种螯合剂的缓冲液并在100C加热12分钟(265-266页:“方案4”)。需要有改善的方法和设备用于简单快速的NA提取，这尽可能减少加工和取样期间NA交叉污染和损失的风险。另一目的是破坏敏感NA(特别是RNA)的步骤更少且时间更少。另一目的是其应仅靶向大样品或序列混合物中的感兴趣序列，或总RNA的mRNA部分。另一目的是使方法和设备简单、可重复及可再生，并能直接从大的介观流控(mesofluidic)样品有效进行序列特异性靶核酸提取和纯化，而用户输入最少。本专利技术涉及实现一些或所有上述目的。
技术实现思路
根据本专利技术，提供具有靶标富集的制备用于分析的核酸样品以的方法，所述方法包括以下步骤：(a)在反应容器中，向样品加入螯合剂直至细胞裂解以提供粗裂解物，和(b)提供PNA探针，浓度足以结合和捕获可识别水平的靶核酸。根据本专利技术另一方面，提供制备核酸样品以用靶标富集分析的设备，所述设备包括反应容器，用于向容器中的样品加入螯合剂直至细胞裂解的装置以提供粗裂解物，和提供PNA探针的装置，探针浓度足以结合和捕获可识别水平的靶核酸。所述设备还可进行任何如下所定义步骤的特征。在一个实施方式中，所述样品与螯合剂一起加热。在一个实施方式中，所述方法包括提供附着PNA探针的珠。优选地，所述珠在细胞裂解后提供且PNA探针有结合靶核酸的时间。在一个实施方
式中，所述珠是顺磁性的或有磁性的。在一个实施方式中，所述珠的尺寸范围是50nm-5μm。在一个实施方式中，所述PNA探针附着反应容器内部或在容器内的溶液中。在一个实施方式中，在粗裂解物冷却到低于裂解物退火温度(如63℃)后，使PNA探针和粗裂解物相互接触。在一个实施方式中，执行步骤(a)，从而靶核酸剪切成片段。在一个实施方式中，所述样品通过磁吸引来部分或完全形成流动。在一个实施方式中，所述螯合剂浓度范围是相对于样品lw/v-20％w/v。在一个实施方式中，所述螯合剂是含亚氨基二乙酸基团的苯乙烯-二乙烯基苯共聚物，如ChelexTM 100树脂(BioRad)。在一个实施方式中，所述加热温度是70℃-99.5℃，优选范围98℃-99.5℃，持续至少5分钟以提供10-11范围的样品pH。在一个实施方式中，所述珠在靶核酸附着PNA探针后磁性移除。在一个实施方式中，所述珠在磁体磁场中的表面上移除。在一个实施方式中，所述珠在磁体磁场中的主体(body)凹处或口袋中移除。在一个实施方式中，所述口袋包括油或蜡的载体。在一个实施方式中，所述油或蜡在反应期间处于液体形式而不施加磁场，并在施加磁场且所述珠被吸引到袋中后引起固化。在一个实施方式中，由于用热裂解，所述油或蜡熔化。在一个实施方式中，定位所述油或蜡，从而使其温度未达到裂解温度，而是更低的温度，其引起油或蜡熔化以释放珠。优选地，所述油或蜡位于样品表面，在容器下端加热，其中油或蜡在熔化时由于漂浮而保持在表面顶部。在一个实施方式中，所述容器细长且垂直的，在其下端加热容器，油或蜡主体被支撑在容器中的样品表面处或附近。在一个实施方式中，所述油或蜡主体被支撑在容器内插入物下端的口袋中，且插入物还包括磁性装置以施加和撤回磁场。在一个实施方式中，所述插入物有内部管道，在所述内部管道内，磁体可从分隔位置移动到足够靠近口袋的位置从而其向油或蜡主体施加磁场。在一个实施方式中，所述油或蜡包含油或蜡的双相和温控的主体以及包括离子液体的水，所述离子液体与水的可混和性根据物理参数如温度或pH而改变。在一个实施方式中，所述螯合剂是离子液体的阴离子或阳离子所具有的官能团，其中当离子液体是水溶性时，该官能团从水性溶液中捕获靶阳离子，且其中物理参数的变化改变离子液体的可混和性，且其中离子液体、官能团和任何所捕获的靶分析物在相间移动，用于移出。在一个实施方式中，离子液体的阴离子或阳离子具有PNA官能团，其中当离子液体是水溶性时，该官能团从水性溶液中捕获靶核酸，且其中物理参数的变化改变离子液体的可混和性，其中离子液体、官能团和任何所捕获的靶分析物以此方式在相间移动，用于提取和纯化靶分析物。另一方面，本专利技术提供微生物写样品制备设备，包括：反应容器，加热器，用于在所述容器下端加热所述容器到足以裂解容器中样品的水平，所述样品带有分析物，探针，支撑物，保持带有包埋的顺磁性的或有磁性的珠的固态油或蜡主体，所述珠具有吸引探针的涂层，其中所述探针固定化于支撑物和/或油或蜡主体的表面和/或容器内表面，磁性装置，用于施加磁场，当蜡或油主体熔化时，在孵育后将珠吸本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种具有靶富集的制备用于分析的核酸样品的方法，所述方法包括步骤：a.在反应容器(7)中，向样品加入螯合剂直至细胞裂解以提供粗裂解物，和b.提供PNA探针，浓度足以结合和捕获可识别水平的靶核酸。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.12.12 EP 13197017.01.一种具有靶富集的制备用于分析的核酸样品的方法，所述方法包括步骤：a.在反应容器(7)中，向样品加入螯合剂直至细胞裂解以提供粗裂解物，和b.提供PNA探针，浓度足以结合和捕获可识别水平的靶核酸。2.如权利要求1所述的方法，其中所述样品与螯合剂一起加热。3.如权利要求1或2所述的方法，包括提供附着PNA探针的珠(26)的步骤。4.如权利要求3所述的方法，其中所述珠在细胞裂解后提供且PNA探针有结合靶核酸的时间。5.如权利要求3或4所述的方法，其中所述珠(26)是顺磁性的或有磁性的。6.如权利要求3-5中任一项所述的方法，其中所述珠的尺寸范围是50nm-5μm。7.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述PNA探针附着反应容器内部或在容器内的溶液中。8.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中在所述粗裂解物冷却到低于裂解物退火温度(如63℃)后，使所述PNA探针和所述粗裂解物接触。9.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中执行所述步骤(a)，从而靶核酸剪切成片段。10.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中通过磁(19)吸引使所述样品部分或全部流动。11.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述螯合剂浓度范围是相对于样品l w/v-20％w/v。12.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述螯合剂是含亚氨基二乙酸基团的苯乙烯-二乙烯基苯共聚物，如ChelexTM 100树脂(BioRad)。13.如权利要求2-12中任一项所述的方法，其中所述加热温度是70℃-99.5℃，优选范围是98℃-99.5℃，持续至少5分钟以提供10-11范围内的样品pH。14.如权利要求3-13中任一项所述的方法，其中所述珠在靶核酸附着PNA探针后磁性移除。15.如权利要求14所述的方法，其中所述珠在磁体磁场中的表面(16)上移除。16.如权利要求15所述的方法，其中所述珠在磁体磁场中的主体的凹处(16)或口袋中移除。17.如权利要求16所述的方法，其中所述口袋包括油或蜡(25)的载体。18.如权利要求17所述的方法，其中所述油或蜡(25)在反应期间不施加磁场的情况下处于液体形式，并在施加磁场且所述珠被吸引到所述口袋中后引起固化。19.如权利要求18所述的方法，其中由于为裂解所施加的加热，所述油或蜡熔化。20.如权利要求19所述的方法，其中定位所述油或蜡，从而其温度未达到裂解温度，而是更低的温度，其引起油或蜡熔化以释放珠。21.如权利要求20所述的方法，其中所述油或蜡位于样品表面，并且在容器下端(2)加热，其中油或蜡在融化时由于漂浮而保持在表面顶部。22.如权利要求21所述的方法，其中所述容器(11)是细长并垂直的，在其下端加热容器，且油或蜡主体(17)被支撑在容器中的样品表面处或其附近。23.如权利要求22所述的方法，其中所述油或蜡主体(17)被支撑在容器内插入物下端的口袋中，且插入物还包含磁性装置以施加和撤回磁场。24.如权利要求23所述的方法，其中所述插入物有内部管道(18)，在所述内部管道内，磁体可从分隔位置移动到足够靠近口袋的位置从而其向油或蜡主体施加磁场。25.如权利要求19-24中任一项所述的方法，其中所述油或蜡包含油或蜡的双相和温控的主体以及包括离子液体的水，所述离子液体与水的可混和性根据物理参数如温度或pH而改变。26.如权利要求1-25中任一项所述的方法，其中所述螯合剂是离子液体的阴离子或阳离子具有的官能团，其中当离子液体是水溶性时，该官能团从水性溶液捕获靶阳离子，且其中物理参数的变化改变离子液体的可混和性...

【专利技术属性】
技术研发人员：B·欧法雷尔，T·卡明斯，C·D·欧沙利文，J·阿尔法雷茨文森特，
申请(专利权)人：阿尔查技术有限公司，
类型：发明
国别省市：爱尔兰;IE