一种提取毛发DNA的方法技术

本发明专利技术公开了一种毛发总DNA提取方法,该方法基于PCR缓冲液法和CTAB法改良之后得到。该方法取毛发近毛囊段，经过无水乙醇和蒸馏水洗涤干燥后，在加有SDS和蛋白酶K的PCR缓冲液中消化后，加入RNA酶去除RNA，然后在高盐环境下加入CTAB结合蛋白质，最后经过氯仿异戊醇抽提，异丙醇沉淀，70％乙醇洗涤，最终得到总DNA样品。该方法针对毛发的特点，兼具PCR缓冲液法能充分释放毛发DNA和改良的CTAB法能高效抽提和纯化DNA的优点。提取过程对毛发DNA释放充分，对蛋白质等杂质去除彻底，且避免了有毒易挥发的苯酚的使用，得到的总DNA相对纯度高，得率好，完整性高，具有广泛的应用前景。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于DNA提取
，涉及一种毛发总DNA提取方法，特别涉及一种基于PCR缓冲液法和CTAB法改良的毛发总DNA的提取方法。
技术介绍
在野生动物特别是珍稀濒危野生动物的保护遗传学研究中，第一步就往往需要获得总DNA。但由于野生动物往往高度警觉且在捕获取样过程中表现强烈的应激反应，损伤性取样方式不但会对野生动物造成严重的损害，而且使得取样难度大大增加。而在样品采集过程中，相对于采集血液和组织，选择采集毛发样品不仅不会对动物个体造成损伤，且毛发的获取过程容易得多。但是往往因为毛发中DNA含量过低，蛋白质含量高，导致目前所用的一般的毛发总DNA提取方法很难得到总量足且质量好、杂质少的总DNA。通常所采用的毛发DNA提取方法中，PCR缓冲液法，是在PCR缓冲液中利用蛋白酶K分解消化的方法。该方法能够使毛发中高达98％的蛋白质物质充分分解，但是往往得到的产物依旧纯度较低，所含的杂质对后续的分子实验(例如PCR反应等)造成不利影响。而CTAB法能够利用CTAB与蛋白质结合，而不与DNA结合的性质，将微量的DNA从大量蛋白质杂质中抽提出来，得到纯度较高的总DNA。结合PCR缓冲液法和CTAB法，并进一步针对毛发的特点进行适当地调整和改良，得到量足且纯度较高的总DNA，将给今后野生动物的保护遗传学研究提供重要的技术支持。
技术实现思路
针对现有技术存在的缺陷，本专利技术的目的是提供一种基于PCR缓冲液法和CTAB法改良的适用于从毛发中提取总DNA的方法，该方法DNA释放充分，抽提损失小，避免采用有毒的苯酚，能够解决PCR缓冲液法提取DNA纯度不高、r/>传统CTAB法抽提过程中DNA损失较大的问题，特别适用于毛干和毛囊直径较小的毛发样品，在珍稀濒危野生动物的保护遗传学研究中具有重要的应用前景。为了实现上述技术目的，本专利技术提供了一种基于PCR缓冲液法和CTAB法改良的毛发总DNA的提取方法，该方法包括以下步骤：一种提取毛发DNA的方法，基于改良的PCR缓冲液法和CTAB法用于提取毛发中的总DNA，包括以下步骤：(1)毛发预处理：取带毛囊的毛发剪碎清洗，清洗完后干燥；(2)毛发消化：向干燥后的毛发加入毛发消化液，所述消化液成分为：1×PCR缓冲液，蛋白酶K，SDS；混匀后置于PCR仪上，设置循环，循环结束后，加入适量RNA酶溶液，混匀静置；(3)DNA抽提：向上述离心管中加入CTAB抽提液，充分混匀，水浴保温，然后加入等体积的24:1的氯仿和异戊醇上下颠倒混匀，置于冰上，4℃下离心，取上清，加入等体积异丙醇，-20℃下沉淀，4℃下离心；小心倒掉上清液，以70％乙醇洗涤，洗涤后干燥离心管，最后向离心管中加入1×TE缓冲液溶解，4℃下保存备用。步骤(1)中毛发样品以顺毛发生长方向拔取于活体动物背部或人类头部，均带毛囊，且数量不少于10根，立即置于无菌干净取样管，液氮速冻，干冰运输，保存于-80℃下。步骤(1)的毛发预处理具体过程：取带毛囊的毛发10～20根，剪取靠近毛囊端3cm，并剪碎装进干净的无菌2ml离心管，用75％乙醇清洗2次，蒸馏水清洗3次，清洗完后真空干燥离心管和样品。步骤(2)中1×PCR缓冲液成分为：50mmol/l KCl，10mmol/l Tris-HCl，2mmol/l MgCl2。步骤(2)中所述的毛发消化液，蛋白酶K的浓度为0.05～1mg/ml，SDS的质量百分含量为0.2～1％。步骤(2)中设置循环：65℃下30min，95℃下15min，4℃下10min，一个循环，循环结束后，加入适量RNA酶溶液，混匀并室温静置5分钟。步骤(3)中CTAB抽提液的成分为：pH8.0的100mmol/L Tris-HCl，20mmol/L EDTA-Na2，1.4mol/LNaCl，2％CTAB，0.1％(V/V)β-巯基乙醇。步骤(3)DNA抽提的具体过程：向步骤(2)的离心管中加入CTAB抽提液，充分混匀，置于65℃恒温水浴锅保温20～30min，然后加入等体积的24:1的氯仿和异戊醇，上下颠倒混匀，置于冰上10min；4℃下12,000×g离心5min，取上清，加入等体积异丙醇，-20℃下沉淀2h，4℃下12,000×g低温离心5min；小心倒掉上清液，以70％乙醇洗涤两次，洗涤后干燥离心管，最后向离心管中加入1×TE缓冲液溶解，4℃下保存备用。本专利技术首先在PCR缓冲液中添加SDS和蛋白酶K，以此作为毛发消化液。PCR缓冲液能给消化反应提供一个合适的pH缓冲环境，且其中的Mg+有助于酶促反应。消化液中的SDS不仅有助于蛋白质变性，适当浓度的SDS还能提高蛋白酶K的活性。65℃下30min，95℃下15min，足够让毛发中的蛋白充分水解，释放出所有DNA。加入CTAB，CTAB在高盐环境下可以与蛋白质、多糖等物质结合，而不与DNA结合。以氯仿：异戊醇(24:1)一步抽提法，替代了苯酚：氯仿：异戊醇(25:24:1)和氯仿：异戊醇(24:1)两步抽提法。避免了使用苯酚，不仅因为它的对人体的毒害性，而且可以防止少量DNA分子溶于苯酚，造成原本就含量低的DNA的损失，使蛋白质最大程度地容易有机相，DNA分子溶于水相。。相对现有技术，本专利技术的技术方案带来的有益技术效果有：毛发总DNA释放充分，抽提效果好。兼有总量足和纯度高、杂质少的优点，可用于后续的各种分子生物学实验研究。附图说明【图1】实施例1中提取的总DNA电泳图；A表示人；B表示恒河猴；C表示懒猴；D表示赤猴；E表示川金丝猴。【图2～图4】实施例2中各物种线粒体DNA片段的PCR扩增电泳图；图中M为100bp DNA Ladder。PCR产物编号采用X-Y形式，X代表物种编号：A表示人；B表示恒河猴；C表示懒猴；D表示赤猴；E表示川金丝猴。Y代表所用不同的引物的编号：1表示用引物12SrRNA-1；2表示用引物12SrRNA-2；3表示用引物D-loop-1；4表示用引物D-loop-2。【图5】实施例3中各物种基因组DNA片段的PCR扩增电泳图。图中M为100bp
DNA Ladder。PCR产物编号采用X-Y形式，X代表物种编号：A表示人；B表示恒河猴；E表示川金丝猴。Y代表所用不同的引物的编号：5表示用引物TRIM5-1；6表示用引物TRIM5-2。具体实施方式以下通过实施例对本
技术实现思路
作进一步阐述，但不作为对本专利技术权利要求保护范围的限定。实施例1取人、川金丝猴、恒河猴、赤猴、懒猴的带毛囊的毛发20根，剪取靠近毛囊端3cm，并剪碎装进干净的无菌2ml离心管。用75％乙醇1ml加入上述清洗2次，蒸馏水清洗3次，每次清洗都用漩涡振荡器震荡5s。清洗完后真空干燥离心管和样品。随后向离心管中加入毛发消化液，所述消化液的配制方法为：加2×PCR缓冲液(100mmol/l KCl，20mmol/l Tris-HCl，4mmol/l MgCl2)172.5μl，蛋白酶K(加入之前20mg/ml)17μl，SDS溶液(加入之前10％)30μl，双蒸水125.5μl。然后将离心管混匀后置于PCR仪上，设置循环：65℃下30min，95℃下15min，4℃下10min，一个循环。循环结束后，毛发完全消化，液体中看不本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种提取毛发DNA的方法，其特征在于，基于改良的PCR缓冲液法和CTAB法用于提取毛发中的总DNA，包括以下步骤：(1)毛发预处理：取带毛囊的毛发剪碎清洗，清洗完后干燥；(2)毛发消化：向干燥后的毛发加入毛发消化液，所述消化液成分为：1×PCR缓冲液，蛋白酶K，SDS；混匀后置于PCR仪上，设置循环，循环结束后，加入适量RNA酶溶液，混匀静置；(3)DNA抽提：向上述离心管中加入CTAB抽提液，充分混匀，水浴保温，然后加入等体积的24:1的氯仿和异戊醇上下颠倒混匀，置于冰上，4℃下离心，取上清，加入等体积异丙醇，‑20℃下沉淀，4℃下离心；小心倒掉上清液，以70％乙醇洗涤，洗涤后干燥离心管，最后向离心管中加入1×TE缓冲液溶解，4℃下保存备用。

【技术特征摘要】
1.一种提取毛发DNA的方法，其特征在于，基于改良的PCR缓冲液法和CTAB法用于提取毛发中的总DNA，包括以下步骤：(1)毛发预处理：取带毛囊的毛发剪碎清洗，清洗完后干燥；(2)毛发消化：向干燥后的毛发加入毛发消化液，所述消化液成分为：1×PCR缓冲液，蛋白酶K，SDS；混匀后置于PCR仪上，设置循环，循环结束后，加入适量RNA酶溶液，混匀静置；(3)DNA抽提：向上述离心管中加入CTAB抽提液，充分混匀，水浴保温，然后加入等体积的24:1的氯仿和异戊醇上下颠倒混匀，置于冰上，4℃下离心，取上清，加入等体积异丙醇，-20℃下沉淀，4℃下离心；小心倒掉上清液，以70％乙醇洗涤，洗涤后干燥离心管，最后向离心管中加入1×TE缓冲液溶解，4℃下保存备用。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)中毛发样品以顺毛发生长方向拔取于活体动物背部或人类头部，均带毛囊，且数量不少于10根，立即置于无菌干净取样管，液氮速冻，干冰运输，保存于-80℃下。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：步骤(1)的毛发预处理具体过程：取带毛囊的毛发10～20根，剪取靠近毛囊端3cm，并剪碎装进干净的无菌2ml离心管，用75％乙醇清洗2次，蒸馏水清洗3次，清洗完后真空干燥离心管和样品。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：1×PCR缓冲液成分为...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘学端，张杜，梁伊丽，刘宏伟，尹华群，
申请(专利权)人：中南大学，
类型：发明
国别省市：湖南;43