CMV疫苗制造技术

本文提供适于作为疫苗用于预防和治疗巨细胞病毒感染和再活化的遗传修饰的沙粒病毒载体。本文还提供用于治疗巨细胞病毒感染和再活化的药物组合物和方法。具体地说，本文提供治疗巨细胞病毒感染和再活化的药物组合物、疫苗和方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】相关申请的交叉引用本申请要求2013年12月3日提交的美国临时申请号61/911,135和2014年9月26日提交的美国临时申请号62/055,699的优先权的权益。所述2个申请通过引用以其整体结合到本文中。1.引言本专利技术总的来说涉及适宜作为用于预防和治疗巨细胞病毒感染和再活化的疫苗的修饰的沙粒病毒。本专利技术还涉及用于治疗巨细胞病毒感染和再活化的药物组合物和方法。具体地说，本文提供治疗巨细胞病毒感染和再活化的药物组合物、疫苗和方法。2.背景2.1医学需要人巨细胞病毒(HCMV)是一种无处不在的β-疱疹病毒，通常在健康个体中引起慢性潜伏性无症状感染，在发达世界中整体年龄调整的CMV血清阳性率超过50％(Bate等,Clin.Infect.Dis.,2010,50(11):1439；La Rosa和Diamond,Future Virol.,2012,7(3):279))。然而，在免疫应答受损的患者中，尤其在移植物接受者、感染HIV的人和先天感染的新生儿中，CMV引起可观的发病率和死亡率，因此呈现出一个重要的公共卫生问题。HCMV感染是发达世界中先天病毒感染的最常见的原因。每年约40,000名先天受感染的婴儿在美国出生。先天性CMV感染可能导致多种神经发育性失能，并表现为儿童听力损失最常见的感染原因。与唐氏综合征或胎儿酒精综合征相比因先天性CMV感染更多儿童患有长期后遗症的事实表明HCMV的巨大公共健康影响(Cannon等，BMC Public Health，2005，5:70)。除了其作为围产期感染的影响以外，HCMV也是移植患者中的感染性并发症的重要原因，引起局限性肺炎、肝炎、胃肠溃疡、视网膜炎和死亡。虽然现今在大多数情况下，可通过用成本密集、常规使用的抗病毒药物抢先疗法来防止终末器官疾病的这些严重形式，但是CMV感染的后期再活化仍是一个问题。此外，CMV引发间接作用，例如移植排斥、在心脏或肺移植或免疫抑制后动脉粥样硬化加快。此外，CMV感染和/或再活化还与HIV患者以及允许进入重症监护病房的患者的死亡率显著相关。2.2 HCMV免疫和疫苗开发先天性CMV的重大公共健康影响引导美国医学研究所将CMV疫苗的开发在其最新报告“21世纪的疫苗”中列为最优先考虑的事项。虽然疫苗开发努力已持续了几十年，但迄今为止仍没有可用的已获许可的CMV疫苗。有效疫苗的开发已被证实是困难的，因为在了解CMV流行病学和传播方面仍有关键性的差距。CMV在健康的有免疫能力的宿主中很少引起疾病，其中针对CMV的免疫提供若干保护水平，并在维持无症状感染中起必不可少的作用。然而，人免疫系统不能够清除感染，且尽管宿主免疫，但CMV通常建立可持续终身的慢性感染。相比之下，在免疫抑制后和在未发育完全的宿主中容易发生不受控制的CMV病毒血症和危急生命的症状。在临床试验中已研究了基于不同技术的若干疫苗候选物。已证实了用诱导CMV特异性抗体应答的活的减毒疫苗候选物和糖蛋白疫苗候选物两者通过疫苗接种引起的部分保护。还表明了用抗体的被动免疫提供某种保护。然而，一旦潜伏性感染建立，则CMV特异性T细胞的强诱导似乎是控制再活化和疾病必需的。2.3 HCMV疫苗抗原一些数据表明抑制CMV进入宿主细胞的中和抗体在防止水平和垂直病毒传播中起重要作用。基于中和成纤维细胞感染的研究把主要包膜糖蛋白B(gB)定义为中和抗体的优势靶标之一。在人CMV疫苗候选物中加入gB得到临床II期数据的进一步支持，该数据表明，基于gB的亚基疫苗与MF59佐剂组合能够在血清反应阴性女性中赋予部分保护(Pass,J.Clin.Virol.,2009,46(Suppl 4):S73；Pass等,N.Eng.J.Med.,2009,360(12):1191)。虽然基于重组gB的疫苗候选物诱导预防HCMV感染的高滴度的中和抗体，但是其它HCMV抗原可诱导抑制特定细胞类型(例如上皮和内皮细胞)的HCMV感染的较高滴度的抗体。有效防止HCMV感染的疫苗策略将取决于诱导抑制病毒进入各种细胞类型的有效中和抗体的能力。最新研究显示由糖蛋白gH/gL(UL75/UL115)、UL128、UL130和UL131A形成的五聚体复合体是HCMV进入上皮和内皮细胞所必需的，并且是HCMV血清反应阳性个体中有效中和抗体的靶标(Ryckman等,J.Virol.,2008,82(1):60；Wang和Shenk,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2005,102:18153；Wussow,等,J.Virol.,2013,87(3):1322)。用于诱导防止由细胞毒性T细胞介导的CMV疾病的潜在疫苗抗原是被膜蛋白(tegument protein)pp65，其是一种免疫显性CD8+T细胞抗原(Wills等,J.Virol.,1996,70(11):7569)。pp65特异性CD8+T细胞频率与移植患者中CMV的免疫控制有关(Pipeling等,J.Infect.Dis.,2011,204(11):1663)，且pp65特异性T细胞的适应性转移显得在造血干细胞移植物接受者中具有治疗用途(Peggs等,Clin Infect Dis 2011,52(1):49；Einsele等,Blood,2002,99(11):3916；Micklethwaite等,Blood,2008,112(10):3974)。总之，这些研究结果表明，被设计成防止移植患者的CMV疾病的CMV疫苗需要加入pp65。3.专利技术概述本专利技术涉及包含选自以下核苷酸序列的感染性复制缺陷型沙粒病毒病毒载体：a.编码CMV糖蛋白gB或其抗原片段的核苷酸序列；b.编码CMV被膜蛋白pp65或其抗原片段的核苷酸序列；c.编码CMV糖蛋白gH或其抗原片段的核苷酸序列；d.编码CMV糖蛋白gL或其抗原片段的核苷酸序列；e.编码CMV UL128蛋白或其抗原片段的核苷酸序列；f.编码CMV UL130蛋白或其抗原片段的核苷酸序列；和g.编码CMV UL131A蛋白或其抗原片段的核苷酸序列。在某些实施方案中，本文提供的病毒载体是感染性的，即能够进入宿主细胞或将其遗传物质注入宿主细胞中。在某些更具体的实施方案中，本文提供的病毒载体是感染性的，即能够进入宿主细胞或将其遗传物质注入宿主细胞中，接着在宿主细胞内扩增并表达其遗传信息。在某些实施方案中，CMV糖蛋白gB或其抗原片段选自SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:30SEQ ID NO:60和SEQ ID NO:63。在某些实施方案中，抗原片段为至少10、25、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800或至少900个氨基酸长。在某些实施方案中，当片段能够(i)在宿主(例如小鼠、兔、山羊或驴)中诱导抗体免疫应答，其中所得抗体与人CMV糖蛋白gB特异性结合；和/或(ii)诱导特异性T细胞免疫应答时，片段是抗原性的。在某些实施方案本文档来自技高网...

【技术保护点】
经改造以含有在被感染的细胞中具有扩增和表达其遗传信息的能力但不能够在正常的非基因工程细胞中产生另外的感染性子代颗粒的基因组的感染性复制缺陷型沙粒病毒病毒载体，其中一个沙粒病毒可读框被除去并被选自以下核苷酸序列取代：a.编码巨细胞病毒糖蛋白gB或其抗原片段的核苷酸序列；b.编码巨细胞病毒被膜蛋白pp65或其抗原片段的核苷酸序列；c.编码巨细胞病毒糖蛋白gH或其抗原片段的核苷酸序列；d.编码巨细胞病毒糖蛋白gL或其抗原片段的核苷酸序列；e.编码巨细胞病毒UL128蛋白或其抗原片段的核苷酸序列；f.编码巨细胞病毒UL130蛋白或其抗原片段的核苷酸序列；和g.编码巨细胞病毒UL131A蛋白或其抗原片段的核苷酸序列。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.12.03 US 61/911,135;2014.09.26 US 62/055,6991.经改造以含有在被感染的细胞中具有扩增和表达其遗传信息的能力但不能够在正常的非基因工程细胞中产生另外的感染性子代颗粒的基因组的感染性复制缺陷型沙粒病毒病毒载体，其中一个沙粒病毒可读框被除去并被选自以下核苷酸序列取代：a.编码巨细胞病毒糖蛋白gB或其抗原片段的核苷酸序列；b.编码巨细胞病毒被膜蛋白pp65或其抗原片段的核苷酸序列；c.编码巨细胞病毒糖蛋白gH或其抗原片段的核苷酸序列；d.编码巨细胞病毒糖蛋白gL或其抗原片段的核苷酸序列；e.编码巨细胞病毒UL128蛋白或其抗原片段的核苷酸序列；f.编码巨细胞病毒UL130蛋白或其抗原片段的核苷酸序列；和g.编码巨细胞病毒UL131A蛋白或其抗原片段的核苷酸序列。2.权利要求1的病毒载体，其中所述糖蛋白gB或其抗原片段包含与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:60或SEQ ID NO:63有80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。3.权利要求1的病毒载体，其中所述pp65抗原与SEQ ID NO:36的pp65抗原或抗原片段有80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。4.权利要求1的病毒载体，其中所述糖蛋白gH与选自SEQ ID NO:39或SEQ ID NO:52的gH抗原或抗原片段有80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。5.权利要求1的病毒载体，其中所述糖蛋白gL与SEQ ID NO:41的gL抗原或抗原片段有80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。6.权利要求1的病毒载体，其中所述UL128与SEQ ID NO:43的UL128抗原或抗原片段有80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。7.权利要求1的病毒载体，其中所述UL130与SEQ ID NO:46的UL130抗原或抗原片段有80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。8.权利要求1的病毒载体，其中所述UL131A与SEQ ID NO:48的UL131A抗原或抗原片段有80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。9.权利要求1的病毒载体，其包含以下的至少两种：a.编码巨细胞病毒糖蛋白gH或其抗原片段的核苷酸序列；b.编码巨细胞病毒糖蛋白gL或其抗原片段的核苷酸序列；c.编码巨细胞病毒UL128蛋白或其抗原片段的核苷酸序列；d.编码巨细胞病毒UL130蛋白或其抗原片段的核苷酸序列；和e.编码巨细胞病毒UL131A蛋白或其抗原片段的核苷酸序列，其中选自上述a至e的2种核苷酸序列被编码自切割肽或通过“核糖体跳跃”导致上游氨基酸序列释放的氨基酸序列的核苷酸序列或导致核糖体的结合和下游序列例如“内部核糖体进入位点”的翻译的序列元件分隔开来。10.权利要求1的病毒载体，其包含以下的至少3种：a.编码巨细胞病毒糖蛋白gH或其抗原片段的核苷酸序列；b.编码巨细胞病毒糖蛋白gL或其抗原片段的核苷酸序列；c.编码巨细胞病毒UL128蛋白或其抗原片段的核苷酸序列；d.编码巨细胞病毒UL130蛋白或其抗原片段的核苷酸序列；和e.编码巨细胞病毒UL131A蛋白或其抗原片段的核苷酸序列，其中选自上述a至e的3种核苷酸序列被编码自切割肽或通过“核糖体跳跃”导致上游氨基酸序列释放的氨基酸序列的核苷酸序列或导致核糖体的结合和下游序列例如“内部核糖体进入位点”的翻译的序列元件分隔开来。11.权利要求1的病毒载体，其包含以下的至少4种：a.编码巨细胞病毒糖蛋白gH或其抗原片段的核苷酸序列；b.编码巨细胞病毒糖蛋白gL或其抗原片段的核苷酸序列；c.编码巨细胞病毒UL128蛋白或其抗原片段的核苷酸序列；d.编码巨细胞病毒UL130蛋白或其抗原片段的核苷酸序列；和e.编码巨细胞病毒UL131A蛋白或其抗原片段的核苷酸序列，其中选自上述a至e的4种核苷酸序列被编码自切割肽或通过“核糖体跳跃”导致上游氨基酸序列释放的氨基酸序列的核苷酸序列或导致核糖体的结合和下游序列例如“内部核糖体进入位点”的翻译的序列元件分隔开来。12.权利要求1的病毒载体，其包含：a.编码巨细胞病毒糖蛋白gH或其抗原片段的核苷酸序列；b.编码巨细胞病毒糖蛋白gL或其抗原片段的核苷酸序列；c.编码巨细胞病毒UL128蛋白或其抗原片段的核苷酸序列；d.编码巨细胞病毒UL130蛋白或其抗原片段的核苷酸序列；和e.编码巨细胞病毒UL131A蛋白或其抗原片段的核苷酸序列，其中上述a至e的5种核苷酸序列被编码自切割肽或通过“核糖体跳跃”导致上游氨基酸序列释放的氨基酸序列的核苷酸序列或导致核糖体的结合和下游序列例如“内部核糖体进入位点”的翻译的序列元件分隔开来。13.权利要求9、10、11或12的病毒载体，其中所述核苷酸序列的表达产生抗原性蛋白质复合物，其比蛋白质复合物组分分别表达诱导更高滴度的中和抗体。14.权利要求9、10、11或12的病毒载体，其中所述自切割肽(或“核糖体跳跃”序列)是猪捷申病毒-1 2A、明脉扁刺蛾β四体病毒2A或口蹄疫病毒2A肽。15.前述权利要求中任一项的病毒载体，其中所述沙粒病毒是淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒。16.前述权利要求中任一项的病毒载体，其中编码沙粒病毒的糖蛋白的可读框缺失或功能性失活。17.前述权利要求中任一项的病毒载体，其中编码感染性复制缺陷型沙粒病毒病毒载体的基因组信息来源于淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒克隆13毒株。18.前述权利要求中任一项的病毒载体，其中编码感染性复制缺陷型沙粒病毒病毒载体的基因组信息来源于淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒MP毒株。19.前述权利要求中任一项的病毒载体，其中所述病毒载体包含基因组区段，其中所述基因组区段包含与SEQ ID NO:31的核苷酸1639-3315或SEQ ID NO:32的1640-3316的序列有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、至少99％或100％同一性的核苷酸序列。20.前述权利要求中任一项的病毒载体，其中所述病毒载体含有包含编码这样的表达产物的核苷酸序列的基因组区段，所述表达产物的氨基酸序列与由SEQ ID NO:31的1639-3315或SEQ ID NO:32的1640-3316编码的氨基酸序列有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、至少99％或100％同一性。21.包含编码巨细胞病毒糖蛋白gB的核苷酸序列的感染性复制缺陷型沙粒病毒病毒载体，其中(i)所述糖蛋白gB的胞质域被异源肽取代；或(ii)所述糖蛋白gB的胞质域和跨膜结构域被异源肽取代。22.权利要求21的病毒载体，其中所述异源肽包含病毒蛋白质的胞质域和跨膜结构域。23.权利要求21的病毒载体，其中所述异源肽是水泡性口炎病毒的G蛋白或流感病毒的血凝素蛋白。24.权利要求21或23的病毒载体，其中所述gB蛋白的跨膜结构域缺失。25.权利要求21或23的病毒载体，其中所述gB蛋白的羧基端被截短。26.权利要求1-24中任一项的病毒载体，其中所述沙粒病毒的生长或感染性不受异源核酸影响。27.包含编码巨细胞病毒糖蛋白gB的核苷酸序列的感染性复制缺陷型沙粒病毒病毒载体，其中(i)所述糖蛋白gB的胞质域缺失；或(ii)所述糖蛋白gB的胞质域和跨膜结构域缺失。28.药物组合物，其包含前述权利要求中任一项的病毒载体和药学上可接受的载体。29.免疫原性组合物，其包含权利要求1-27中任一项的病毒载体和药学上可接受的载体。30.疫苗，其包含权利要求1-27中任一项的病毒载体和药学上可接受的载体。31.治疗或预防患者的巨细胞病毒感染的方法，其中所述方法包括给予患者权利要求1-27中任一项的病毒载体、权利要求28的药物组合物、权利要求29的免疫原性组合物或权利要求30的疫苗。32.权利要求1-27中的免任一项的病毒载体、权利要求28的药物组合物、权利要求29疫原性组合物或权利要求30的疫苗用于治疗或预防患者的巨细胞病毒感染的用途。33.权利要求32的用途，其中所述权利要求1-27中任一项的病毒载体、权利要求28的药物组合物、权利要求29的免疫原性组合物或权利要求30的疫苗适于肌内注射。34.核酸，其包含编码包含CMV糖蛋白gB或其片段和异源多肽的融合蛋白的核苷酸序列。35.权利要求34的核酸，其中(i)所述糖蛋白gB的胞质域被异源肽的胞质域取代；或(ii)所述糖蛋白gB的胞质域和跨膜结构域被异源肽的胞质域和跨膜结构域取代。36.权利要求34或35的核酸，其中所述异源蛋白质是水泡性口炎病毒的G蛋白或流感病毒的血凝素蛋白。37.权利要求34或35或36的核酸，其中所述gB蛋白的跨膜结构域缺失。38.融合蛋白，其包含CMV糖蛋白gB或其片段和异源多肽。39.权利要求38的融合蛋白，其中所述糖蛋白gB的胞质域被异源蛋白质的胞质域取代。40.权利要求38或39的融合蛋白，其中所述异源蛋白质是水泡性口炎病毒的G蛋白或流感病毒的血凝素蛋白。41.权利要求38或39或40的融合蛋白，其中所述gB蛋白的跨膜结构域缺失。42.药物组合物，其包含权利要求34或35或36或37的核酸或权利要求38或39或40或41的融合蛋白。43.分离的核酸，其中所述核酸编码沙粒病毒基因组区段，其中基因组区段的一个可读框缺失或功能性失活且其中所述基因组区段包含以下的一个或多个：a.编码巨细胞病毒糖蛋白gB或其抗原片段的核苷酸序列；b.编码巨细胞病毒被膜蛋白pp65或其抗原片段的核苷酸序列；c.编码巨细胞病毒糖蛋白gH或其抗原片段的核苷酸序列；d.编码巨细胞病毒糖蛋白gL或其抗原片段的核苷酸序列；e.编码巨细胞病毒UL128蛋白或其抗原片段的核苷酸序列；f.编码巨细胞病毒UL130蛋白或其抗原片段的核苷酸序列；和g.编码巨细胞病毒UL131A蛋白或其抗原片段的核苷酸序列。44.权利要求43的分离的核酸，其中所述基因组区段是短区段，其中编码GP的可读框缺失。45.权利要求43或44的分离的核酸，其中所述基因组区段包含CMV糖蛋白gB或其片段和异源多肽。46.权利要求45的分离的核酸，其中(i)所述糖蛋白gB的胞质域被异源蛋白质的胞质域取代；或(ii)所述糖蛋白gB的胞质域和跨膜结构域被异源蛋白质的胞质域和跨膜结构域取代。47.权利要求46的分离的核酸，其中所述异源蛋白质是水泡性口炎病毒的G蛋白或流感病毒的血凝素蛋白。48.权利要求47的分离的核酸，其中所述gB蛋白的跨膜结构域缺失。49.用于产生感染性复制缺陷型沙粒病毒病毒载体的方法，所述方法包括：a.将权利要求43、44、45、46、47或48中任一项的核酸转染至宿主细胞中；b.将宿主细胞在适于病毒形成的条件下维持；和c.收获感染性复制缺陷型沙粒病毒病毒载体；其中所述宿主细胞表达基因组区段缺失或功能性失活的可读框。50.重组LCMV毒株MP。51.分离的核酸，其编码选自以下氨基酸序列：(i)与S...

【专利技术属性】
技术研发人员：克劳斯·奥尔林格，卡伦·林格纳乌，托马斯·莫纳思，法尔沙德·圭拉霍奥，格哈德·富尔曼，凯瑟琳·科恩，维拉·鲍姆加特尔斯特拉瑟，安德列亚斯·埃斯珀克，曼纽拉·凯纳，伯尔哈德·布里姆，贝蒂娜·基埃弗曼，伊丽莎白·沃森，马里奥·埃斯特雷斯纳，卡塔琳娜·拜尔，埃尔莎·穆尔巴彻，
申请(专利权)人：霍欧奇帕生物科技股份公司，
类型：发明
国别省市：奥地利;AT