一种大量提取细菌质粒的方法技术

本发明专利技术属于生物工程技术领域，具体涉及一种快速、简便、大量提取细菌质粒的方法。该方法包括筛选获得含有质粒的原核细胞、玻璃珠悬起菌落、裂解细胞、提取质粒等步骤。本申请通过对细菌中质粒提取操作流程的优化，结果表明，利用玻璃珠悬起菌落并快速提取质粒的方法在原核表达系统中具有较好的应用效果，可较为快速的获得大量质粒，为转基因、BAC文库构建、细胞转染等应用研究奠定基础。由于该方法不需大量摇菌培养，操作较为方便，因而操作成本较为低廉；同时由于不需要大型的高速低温离心机的使用，且能够较为快速的大量提取质粒，因而对于缩短实验时间，提高实验效率具有较好地应用价值。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物工程
，具体涉及一种快速、简便、大量提取细菌质粒的方法。
技术介绍
质粒DNA的提取是分子生物学中基础工作之一，而获得足够用量的质粒DNA是保证后续转基因、BAC文库构建、细胞转染等研究工作的重要前提条件，只有在足够用量质粒基础上，才能进一步利用花粉管法或其他方法将外源基因导入动植物基因组中，并进而对特定基因功能进行研究。现有技术中，为较为便捷的提取质粒，国内外很多生物试剂公司都研制了与提取质粒技术相关的商品化试剂盒。但该类试剂盒均以纯化柱为主，成本高，价格昂贵，并且利用其进行大量质粒DNA提取时，需要配置大量的培养液，并进行大量的摇菌培养，且需要特定的离心机，耗时费力，加大了实验的工作量，使得实验时间显著延长，影响生物学实验操作效率和实验结果。就质粒提取方法而言，现有技术中，利用玻璃珠悬起菌落并快速提取质粒的方法在真核表达系统例如酵母菌株中有所应用，但该方法在原核表达系统尤其是大肠杆菌的质粒提取中是否能够获得较好的应用效果则缺乏相关的报道，同时由于真核表达系统与原核表达系统本身的巨大差异，该方法能否应用于原核表达系统也是未知的。由于原核表达系统应用十分广泛，因而极有必要就细菌中大量质粒提取方法进行进一步改进，从而为相关基因研究及原核表达系统的应用奠定良好基础。
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种简化的、较为快速的提取大量细菌质粒的方法，从而为相关基因研究奠定良好应用基础。本专利技术所采取的技术方案详细介绍如下一种大量提取细菌质粒的方法，包括如下步骤：（1）筛选获得含有质粒的重组的原核细胞，具体为：首先，在将目的质粒转化原核细胞后，挑取含有质粒的原核细胞的单菌落接种于含有抗性抗生素的液体培养基中，进行扩大培养；其次，吸取扩大培养后的菌液涂布于含有抗性抗生素的固体培养基的平板上，培养过夜；最后，在平板上加入无菌水和灭菌的玻璃珠摇晃，利用玻璃珠悬起菌落；待培养基中无菌落残留时，将含有菌落的无菌水吸出，置于离心管中，离心弃上清，保留沉淀，即为含有质粒的细菌细胞（原核细胞）；本申请中所述原核细胞为细菌细胞，具体例如为大肠杆菌细胞；（2）裂解细胞，具体为：在步骤（1）中离心后沉淀中加入溶液I，震荡重悬菌体，静置3~5min；然后加入溶液II，混匀后，冰上放置3~5min；再加入溶液III，混合均匀，并冰上放置3~5min；所述溶液I，每升溶液中的组份为：1MTris-HCL（pH=8.0）、50mL，0.5MEDTA、20mL，其余为ddH2O，pH=7.5，高温灭菌；所述溶液II，每升溶液的配制方法为：0.4M的NaOH的ddH2O溶液与质量浓度2%的SDS的ddH2O溶液的等体积混合液；0.4M的NaOH的ddH2O溶液可由8gNaOH溶于500mL的ddH2O中配制而成，质量浓度2%的SDS的ddH2O溶液可由10gSDS溶于500mL的ddH2O中配制而成；需要强调的是，溶液II需现配现用；所述溶液III，每升溶液的制备方法为：在600mL的ddH2O中依次加入129.69g的KAc和100mL冰乙酸，溶解并混合均匀后，乙酸调节pH=4.8，然后用ddH2O定容至1L，并最终调节pH=4.8；（3）提取质粒，具体为：将步骤（2）中冰上放置后溶液离心，弃沉淀，取上清液于离心管中，加入等体积量的氯仿-异戊醇混合液，混合均匀，放置15~25min；所述氯仿-异戊醇混合液中，以体积比计，氯仿：异戊醇=24：1；将放置后混合液离心，取上清液置于预先加有无水乙醇的离心管中，离心，弃上清，再用体积分数75%的乙醇漂洗沉淀后，即为所提取的质粒；离心管中预先加入的无水乙醇的量优选为上清液2倍体积的量，所加入无水乙醇优选为-20℃预冷的无水乙醇；所提取的质粒在干燥后，可溶于TE缓冲液中，-80℃保存备用。本申请通过对细菌中质粒提取操作流程的优化，结果表明，利用玻璃珠悬起菌落并快速提取质粒的方法在原核表达系统中具有较好的应用效果，可较为快速的获得大量质粒，为转基因、BAC文库构建、细胞转染等应用研究奠定基础。由于该方法不需大量摇菌培养，操作较为方便，因而操作成本较为低廉；同时由于不需要大型的高速低温离心机的使用，且能够较为快速的大量提取质粒，因而对于缩短实验时间，提高实验效率具有较好地应用价值。附图说明图1为玻璃珠悬起菌落图；图2为本专利技术的质粒提取方法和常规大提质粒试剂盒的提取方法在提取重组质粒pMDC83-pTaWG04-GUS时的电泳结果对比图，其中：M为MarkerⅣ，1-6泳道为挑取的6个阳性单克隆pMDC83-pTaWG04-GUS用常规试剂盒提取质粒的电泳图，7-13泳道为挑取的7个阳性单克隆pMDC83-pTaWG04-GUS用本专利技术的质粒提取方法提取质粒的电泳图；图3为目标基因pTaWG04在提取质粒中的PCR扩增后的电泳图；其中M为MarkerⅣ，1-3泳道为利用提取的质粒为模板进行目标条带pTaWG04的PCR扩增结果；图4为质粒酶切结果；其中泳道M为MarkerⅣ，泳道1为质粒小提酶切结果，泳道2为本专利技术方法所提质粒酶切结果。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术做进一步的解释说明。介绍具体实施例前，对本专利技术中涉及的部分物料及试验设备情况简要介绍说明如下。生物材料及实验试剂：大肠杆菌DH5α菌株，为TaKaRa公司商品化产品；植物表达载体pMDC83：由华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室涂金星教授赠予；植物表达载体pBI101：购自于Clontech公司；常规QIAGEN的大提质粒试剂盒：购自于QIAGEN公司；常规小提质粒试剂盒：购自于天根生化科技公司；溶液I，每升溶液中的组份为：1MTris-HCL（PH=8.0）、50mL，0.5MEDTA、20mL，其余为ddH2O，PH=7.5，高温灭菌；溶液II，每升溶液的配制方法为：0.4M的NaOH的ddH2O溶液与质量浓度2%的SDS的ddH2O溶液的等体积混合液；0.4M的NaOH的ddH2O溶液可由8gNaOH溶于500mL的ddH2O中配制而成，2%SDS溶液可由10gSDS溶于500mL的ddH2O中配制而成；溶液II现配现用；溶液III，每升溶液的制备方法为：在600mL的ddH2O中依次加入129.69g的KAc和100mL冰乙酸，溶解并混合均匀后，乙酸调节pH=4.8，然后用ddH2O定容至1L，最终确定pH=4.8；溶液I、溶液II、溶液III配制时按现有技术配制即可，相关物料也为常规商品化试剂或物料，不再赘述。实施例本实施例以含有TaWG04启动子的pMDC83质粒为例，对该重组质粒进行了提取实验，相关过程简要介绍如下。由于重组质粒的构建是相关转基因操作的基础，因而首先就含有TaWG04启动子（pTaWG04）的重组质粒的构建过程简要介绍如下，pTaWG04启动子碱基序列如SEQIDNO.1所示。第一，首先利用HindIII+EcoRI对pBI101进行双酶切，获得GUS基因，然后利用HindIII+EcoRI对质粒pMDC83进行双酶切，最后，利用T4DNA连接酶将酶切产物进行连接，即，将GUS基因融合到pMDC83上，构建获得pMDC83-GUS重组载体。酶切时的双酶切体系设计为：10×FastDige本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种大量提取细菌质粒的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：（1）筛选获得含有质粒的原核细胞，具体为：首先，在将目的质粒转化原核细胞后，挑取含有质粒的原核细胞的单菌落接种于含有抗性抗生素的液体培养基中，进行扩大培养；其次，吸取扩大培养后的菌液涂布于含有抗性抗生素的固体培养基的平板上，培养过夜；最后，在平板上加入无菌水和灭菌的玻璃珠摇晃，利用玻璃珠悬起菌落；待培养基中无菌落残留时，将含有菌落的无菌水吸出，置于离心管中，离心弃上清，保留沉淀，即为含有质粒的原核细胞；（2）裂解细胞，具体为：向步骤（1）中离心后沉淀中加入溶液I，震荡重悬菌体，静置3~5min；然后加入溶液II ，混匀后，冰上放置3~5min；再加入溶液III，混合均匀，并冰上放置3~5min；所述溶液I，每升溶液中的组份为：1M Tris‑HCL、50mL，0.5M EDTA、20mL，其余为ddH2O，pH=7.5，灭菌；所述溶液II，每升溶液的配制方法为：0.4M 的NaOH的ddH2O溶液与质量浓度2%的SDS的ddH2O溶液的等体积混合液；所述溶液III，每升溶液的制备方法为：在600mL的ddH2O中依次加入129.69g的KAc和100mL冰乙酸，溶解并混合均匀后，乙酸调节pH=4.8，然后用ddH2O定容至1L；（3）提取质粒，具体为：将步骤（2）中冰上放置后的溶液离心，弃沉淀，取上清液于离心管中，加入氯仿‑异戊醇混合液，混合均匀，放置15~25min；将放置后混合液离心，取上清液置于预先加有无水乙醇的离心管中，离心，弃上清，再用乙醇漂洗沉淀后，即为所提取的质粒。...

【技术特征摘要】
1.一种大量提取细菌质粒的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：（1）筛选获得含有质粒的原核细胞，具体为：首先，在将目的质粒转化原核细胞后，挑取含有质粒的原核细胞的单菌落接种于含有抗性抗生素的液体培养基中，进行扩大培养；其次，吸取扩大培养后的菌液涂布于含有抗性抗生素的固体培养基的平板上，培养过夜；最后，在平板上加入无菌水和灭菌的玻璃珠摇晃，利用玻璃珠悬起菌落；待培养基中无菌落残留时，将含有菌落的无菌水吸出，置于离心管中，离心弃上清，保留沉淀，即为含有质粒的原核细胞；（2）裂解细胞，具体为：向步骤（1）中离心后沉淀中加入溶液I，震荡重悬菌体，静置3~5min；然后加入溶液II，混匀后，冰上放置3~5min；再加入溶液III，混合均匀，并冰上放置3~5min；所述溶液I，每升溶液中的组份为：1MTris-HCL、50mL，0.5MEDTA、20mL，其余为ddH2O，pH=7.5，灭菌；所述溶液II，每升溶液的配制方法为：0.4M的NaOH的ddH2O溶液...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴政卿，周正富，杨攀，常阳，秦毛毛，雷振生，晁岳恩，王亚欢，王美芳，何盛莲，李文旭，汪庆昌，张琨，柳东阳，刘加平，徐福新，李巍，
申请(专利权)人：河南省农业科学院小麦研究所，
类型：发明
国别省市：河南;41