本发明专利技术涉及乌塌菜总RNA的高效提取方法，通过向乌塌菜叶片中加入液氮研磨、提高离心转速、使用不同浓度乙醇洗涤RNA沉淀等操作，可实现高纯度高浓度、且无降解的乌塌菜总RNA的提取。本发明专利技术首次提供一套科学系统地从乌塌菜叶片中提取总RNA的方法，不仅提高了提取效率，又可有效避免提取过程中的污染，导致RNA降解，采用本方法仅需50-55min即可完成乌塌菜总RNA的提取，获得的高纯度高浓度无降解的总RNA，有利于后续研究的深入。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术设及植物RNA的提取工艺，具体地说，设及乌塌菜总RNA的高效提取方法。
技术介绍
乌塌菜又名塌菜、黑菜等，为十字花科芸臺属白菜亚种的一个变种，W墨绿色叶片 供食，主要分布于我国长江流域。目前，针对乌塌菜的分子生物学研究，尚未建立适宜的RNA 提取方法。 乌塌菜细胞在细胞壁破碎后，所含多糖、蛋白质等次生代谢物W不同方式干扰RNA 的提取，细胞内W及操作体系中存在的RNA酶将会对分离组织中的RNA进行降解，从而影响 后续研究。本专利技术在充分借鉴十字花科其他作物RNA提取方法的基础之上，建立了乌塌菜总 RNA高效提取方法。
技术实现思路
本专利技术旨在提供一种获得高纯度高浓度无降解的乌塌菜总RNA的高效提取方法。 为了实现本专利技术目的，本专利技术提供的乌塌菜总RNA的高效提取方法，包括W下步 骤： 1)取乌塌菜叶片(新鲜嫩叶)加入液氮快速研磨成粉末，倒入离屯、管中； 2)向上述粉末中加入化izol裂解液，将离屯、管置于旋窝机中震荡后室溫静置，然 后4°C离屯、；[000引3)将上清液置于另一离屯、管中，向上清液中加氯仿，震荡后室溫静置，然后4°C离 屯、； 4)将上清液转移至另一离屯、管中，加异丙醇上下颠倒摇匀，-20°C静置后，4°C离 屯、； 5)弃去上清液，用不同浓度的乙醇洗RNA沉淀，4°C离屯、，弃去上清液，RNA置于超净 工作台室溫干燥后(注意不要过分干燥），用不含RNA酶的灭菌水溶解，-80°C保存。 前述的方法，步骤1)具体为:取乌塌菜叶片(新鲜嫩叶)〇.lmg，剪碎后，分2-3次加 入15-20mL液氮，在3-5min内迅速将叶片充分研磨成粉末，操作在超净工作台上完成(避风 环境）。 前述的方法，步骤2)具体为：向步骤1)的粉末中加入1-1.5mL化izol裂解液，将离 屯、管置于旋窝机中剧烈震荡后室溫静置3-5min，然后4°C，12000巧m离屯、3-5min。 前述的方法，步骤3)具体为:将步骤2)所得上清液置于另一离屯、管中，向上清液中 加0.15-0.3mL氯仿，盖紧离屯、管，用手剧烈摇荡15-30S后，室溫静置3-5min，然后4°C， 13000巧m 离屯、5-15min。 前述的方法，步骤4)具体为:将步骤3)所得上清液转移至另一离屯、管中，加等体积 的4°C异丙醇，上下颠倒摇匀，-20°C静置3-5min，然后4°C，13000巧m离屯、5-15min。 前述的方法，步骤5)具体为:弃去上清液，RNA沉淀用0.5-1.0血75 %乙醇冲洗2次， 然后4°C，13000巧m离屯、3-5min;弃去上清液，RNA沉淀再用ο. 5-1.5mL无水乙醇冲洗1次，然 后4°C，13000巧m离屯、3-5min;去除乙醇，RNA置于超净工作台室溫干燥3-5min，然后用不含 RNA酶的灭菌水SO-lOOiiL溶解，-80°C保存。 优选地，所述方法包括W下步骤： 1)取乌塌菜叶片(新鲜嫩叶)0.1 mg，剪碎后，分2-3次加入20mL液氮，在3min内将叶 片研磨成粉末，倒入离屯、管中，操作在超净工作台上完成(避风环境）； 2)向上述粉末中加入ImL化izol裂解液，将离屯、管置于旋窝机中剧烈震荡后室溫 静置3min，然后4°C，12000巧m离屯、5min; 3)将上清液置于另一离屯、管中，向上清液中加0.2mL氯仿，盖紧离屯、管，用手剧烈 摇荡20s后，室溫静置5min，然后4°C，13000巧m离屯、lOmin; 4)将上清液转移至另一离屯、管中，加等体积的4°C异丙醇，上下颠倒摇匀，-20°C静 置 5min，然后 4°C，13000巧m 离屯、lOmin; 5)弃去上清液，RNA沉淀用0.8血75%乙醇冲洗2次，然后4°C，13000rpm离屯、5min; 弃去上清液，RNA沉淀再用1. OmL无水乙醇冲洗1次，然后4°C，13000巧m离屯、5min;去除乙醇， RNA置于超净工作台室溫干燥3-5min(注意不要过分干燥），然后用不含RNA酶的灭菌水80化 溶解，-80°C保存。 本专利技术基于目前从乌塌菜中提取植物总RNA存在的诸多问题，提供一套科学系统 地提取高浓度高纯度的乌塌菜总RNA的方法，获得的高浓度高纯度的基因组RNA有利于后续 研究的深入。 本方法具有W下优点： ( - )加快研磨速度。通过向乌塌菜叶片中加入液氮，既提高了研磨效率，又可避免 研磨过程中污染所导致的RNA降解。 (二)加入裂解液震荡后再静置，可使组织裂解更彻底。 (Ξ)通过提高离屯、转速，使提取率更高。(四）用不同浓度乙醇洗RNA沉淀，可提高RNA纯度。(五)节省了提取时间。采用本方法仅需50-55min即可完成乌塌菜总RNA的提取。【附图说明】 图1为本专利技术实施例4中采用不同方法提取乌塌菜总RNA的琼脂糖凝胶电泳结果； 其中，1为普通化izol提取法，2为试剂盒提取法，3为实施例1的高效提取法。【具体实施方式】 W下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。若未特别指明，实施例 中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。 实施例1乌塌菜总RNA的高效提取方法 1、取乌塌菜新鲜嫩叶0.1 mg，剪碎后，分2-3次加入20mL液氮，在3min内将叶片研磨 成粉末，倒入离屯、管中，操作在超净工作台上完成(避风环境）。 2、向上述粉末中加入ImL化izol裂解液，将离屯、管置于旋窝机中剧烈震荡后室溫 静置3min，然后4°C，12000巧m离屯、5min。 3、将上清液置于另一离屯、管中，向上清液中加0.2mL氯仿，盖紧离屯、管，用手剧烈 摇荡20s后，室溫静置5min，然后4°C，13000巧m离屯、lOmin。 4、将上清液转移至另一离屯、管中，加等体积的4°C异丙醇，上下颠倒摇匀，-20°C静 置 5min，然后 4°C，13000巧m 离屯、lOmin。 5、弃去上清液，RNA沉淀用0.8血75%乙醇冲洗2次，然后4°C，13000rpm离屯、5min; 弃去上清液，RNA沉淀再用1. OmL无水乙醇冲洗1次，然后4°C，13000巧m离屯、5min;去除乙醇， RNA置于超净工作台室溫干燥3-5min(注意不要过分干燥），然后用不含RNA酶的灭菌水80化 溶解，-80°C保存。 实施例2乌塌菜总RNA的高效提取方法 1、取乌塌菜新鲜嫩叶0.1 mg，剪碎后，分2-3次加入20mL液氮，在5min内将叶片研磨 成粉末，倒入离屯、管中，操作在超净工作台上完成(避风环境）。 2、向上述粉末中加入1.2mL Trizol裂解液，将离屯、管置于旋窝机中当前第1页1 2 本文档来自技高网...
【技术保护点】
乌塌菜总RNA的高效提取方法，其特征在于，包括以下步骤：1)取乌塌菜叶片加入液氮快速研磨成粉末，倒入离心管中；2)向上述粉末中加入Trizol裂解液，将离心管置于旋窝机中震荡后室温静置，然后4℃离心；3)将上清液置于另一离心管中，向上清液中加氯仿，震荡后室温静置，然后4℃离心；4)将上清液转移至另一离心管中，加异丙醇上下颠倒摇匀，‑20℃静置后，4℃离心；5)弃去上清液，用不同浓度的乙醇洗RNA沉淀，4℃离心，弃去上清液，RNA置于超净工作台室温干燥后，用不含RNA酶的灭菌水溶解，‑80℃保存。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：汪承刚，方柔，刘思嘉，陈国户，袁凌云，朱世东，葛继涛，
申请(专利权)人：安徽农业大学，
类型：发明
国别省市：安徽;34
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