【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于植物生物，具体涉及甘蓝型油菜 bnlyk基因及其在菌核病防控中的应用。
技术介绍
1、在基因编辑技术之前，自然、物理或化学诱变和随机插入转基因dna是在细胞内产生基因突变的主要方法。然而，就其本质而言，这些方法都不能在特定的期望位点上实现基因编辑，传统方法由于诱变随机性高，效率低下，并且对于大多数情况来说是耗时、费力以及高成本处于劣势。传统的基因编辑工具主要包括锌指核酸酶(zfns)，转录激活因子效应核酸酶(talens)，直到2020年crispr技术才逐渐进入人们的视角。与第一代和第二代基因编辑技术相比，crispr技术简单，可操作性强，并且其靶标识别仅仅通过一段短的rna序列就可以识别到不同基因的相同位点，这些优点极大地促进了该技术的发展。在用crispr系统成功的对拟南芥和水稻基因组进行修饰之后，该系统便被广泛的应用于油菜、小麦、黄瓜和番茄等各种农作物的基因编辑。
2、植物免疫反应是植物受外源胁迫后所引发的一系列防御反应，这些反应受基因调控。植物利用许多细胞表面和细胞内的免疫受体来感知与病原体感染相关的各种免疫源性信号，并激活植物防御。细胞表面的模式识别受体（prrs）是植物感知病原激发子的关键因子并能激活pti，其中包括两种细胞表面蛋白：受体样激酶（rlks）和受体样蛋白（rlps）。因此，利用这一类基因研究植物对病原物的免疫调控功能有利于创制出抗病效果好，对不同病原物具有广谱抗性的优良材料。
3、菌核病由核盘菌侵染导致。核盘菌对植
技术实现思路
1、鉴定关键的抗菌核病调控基因，通过育种技术创制并合理利用高抗品种，对于油菜菌核病的防控与绿色发展有十分重要的意义。基于此，本专利技术通过长期的研究以及基因编辑技术发现了甘蓝型 油菜抗核盘菌基因bnlyk，bnlyk基因包括2个同源拷贝基因，分别为 bnlyk.a05基因和 bnlyk.c05基因；其中 bnlyk.a05的核苷酸序列如seq id no .1所示， bnlyk.c05的核苷酸序列如seq id no .2所示。
2、本专利技术以westar品种为背景，通过crispr/cas9技术靶向敲除 bnlyk的2个同源拷贝基因（ bnlyk.a05和 bnlyk.c05），获得纯合的双突变体株系，该纯合的双突变导致油菜基因 bnlyk功能缺失，导致抗核盘菌感染的能力降低 ，菌核病易发。
3、由此，本专利技术提供了可以将 bnlyk基因用于菌核病防控中，即通过上调甘蓝型 油菜 bnlyk基因的表达来对油菜菌核病进行防控，所述菌核病由核盘菌感染导致。
4、本专利技术也提供了一种筛选抗菌核病油菜的方法，通过检测油菜中 bnlyk基因，如果油菜中出现 bnlyk基因纯合型双突变导致功能缺失，那么该油菜的抗菌核病能力差。如果油菜中 bnlyk基因的表达较野生型的表达显著增高，那么该品种的抗菌核病能力强。
5、基于本专利技术的研究，本专利技术还提供了一种甘蓝型 油菜bnlyk纯合突变体转基因植株的制备方法，所述方法包括如下步骤：
6、（1）设计能够同时靶向 bnlyk.a05和bnlyk.c05的通用sgrna序列作为靶点，将该序列克隆到crispr/cas9载体上；其中sgrna序列如seq id no .3所示， bnlyk.a05的核苷酸序列如seq id no .1所示， bnlyk.c05的核苷酸序列如seq id no .2所示；
7、（2）将步骤（1）中含sgrna的crispr/cas9载体通过电击转化法导入对油菜侵染能力强的农杆菌中；
8、（3）通过农杆菌侵染油菜下胚轴的方式将上述农杆菌载体转入油菜，获得转基因油菜植株；
9、（4）对转基因植株进行检测，筛选鉴定出纯合基因型的转基因植株。
10、上述方法可以用于甘蓝型油菜 bnlyk基因功能研究，对于探索植物免疫抗菌机制和信号通路有着重要的实用价值。
11、本专利技术以westar品种为背景，通过crispr/cas9技术靶向敲除 bnlyk的2个同源拷贝基因（ bnlyk.a05和 bnlyk.c05），并获得纯合的双拷贝突变体株系，具体突变类型如附图1所示。进一步的，本专利技术揭示了该基因的突变能够显著增强油菜对核盘菌的敏感性，揭示了该基因在油菜对核盘菌抗性中的强烈正调控作用，为今后油菜对菌核病的绿色防控提供新的思路。
12、有益效果
13、本专利技术首次发现油菜抗菌核病相关基因 bnlyk基因，为油菜菌核病的防治，以及油菜抗病株的选育奠定了基础。
14、本专利技术提供了甘蓝型油菜 bnlyk纯合突变体转基因植株的制备方法，油菜 bnlyk基因功能研究和植物免疫抗菌机制。
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1.一种甘蓝型油菜抗核盘菌基因BnLYK，其特征在于，BnLYK基因包括2个同源拷贝基因，分别为BnLYK.A05基因和BnLYK.C05基因；其中BnLYK.A05的核苷酸序列如SEQ ID NO .1所示，BnLYK.C05的核苷酸序列如SEQ ID NO .2所示。
2.根据权利要求1所述的BnLYK基因在菌核病防控中的应用，其特征在于，通过上调甘蓝型油菜BnLYK基因的表达来对油菜菌核病进行防控，所述菌核病由核盘菌感染导致。
3.一种筛选抗菌核病油菜的方法，其特征在于，检测油菜中BnLYK基因，如果油菜中BnLYK基因出现纯合型双突变导致功能缺失，那么该油菜的抗菌核病能力差。
4.一种甘蓝型油菜BnLYK纯合突变体转基因植株的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
【技术特征摘要】
1.一种甘蓝型油菜抗核盘菌基因bnlyk，其特征在于，bnlyk基因包括2个同源拷贝基因，分别为bnlyk.a05基因和bnlyk.c05基因；其中bnlyk.a05的核苷酸序列如seq id no .1所示，bnlyk.c05的核苷酸序列如seq id no .2所示。
2.根据权利要求1所述的bnlyk基因在菌核病防控中的应用，其特征在于，通过...
【专利技术属性】
技术研发人员：张华建，郝兴黔，孙敏，刘英军，陈姣，朱宗河，张婷，葛莎婷，余燕，
申请(专利权)人：安徽农业大学，
类型：发明
国别省市：
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