【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
技术介绍
1、与mrna结合以调节疾病相关蛋白的产生的治疗性寡核苷酸已成为用于治疗各种疾病领域的新药物形式(khvorova等人nat.biotechnol.2017,35,238)。近年来，随着因发现rna干扰技术而获得诺贝尔奖以及fda批准了若干种基于rna的用于治疗罕见疾病的治疗剂，人们对治疗性寡核苷酸进行了大量投资。目前有超过160种寡核苷酸产品正在进行临床试验，包括用于基于人群的适应症的寡核苷酸产品(hugget等人nat.biotechnol.2017,35,708)。潜在治疗剂(包括用于常见疾病的治疗剂)数量的增加产生了重大的制造挑战，因为现有的化学合成方法仅限于10kg批次并且不适用大规模应用(>100kg)(tedebark等人methods mol.biol.2011,683,505)。
2、治疗性寡核苷酸是短dna类似物，其通过沃森-克里克(watson-crick)碱基配对来选择性地结合靶mrna，以调控疾病相关蛋白的产生。它们包括被称为小干扰rna(sirna)的双链rna分子和被称为反义寡核苷酸(aso)的单链分子。虽然寡核苷酸已作为潜在药物分子被研究超过40年，但将其转化为成功的治疗剂的进展却受到生物功效不足、生物利用度不足和非途径毒性作用的限制。近年来，已报告了多种化学修饰，其显著改善寡核苷酸递送、代谢稳定性和效力，所述修饰包括对dna骨架、嘧啶碱基和核糖的取代(图1)(khvorova等人，同上；rinaldi等人nat.rev.neurol.2018,1,9；和smith等
3、治疗性寡核苷酸可能需要化学修饰以提高功效、选择性、代谢稳定性和毒性特征(rinaldi等人nat.rev.neurol.2018,1,9；smith等人annu.rev.pharmacol.toxicol.2019,59,605)。虽然天然聚合酶能够耐受一些核苷酸修饰(nakamaye等人nucleic acidsres.1988,21,9947；yang等人nucleic acids res.2007,35,3118；romaniuk等人j.biol.chem.1982,257,7684)，但它们的活性可能会受到损害。
4、如今，sirna和aso作为一种新药物形式出现，产生重大的制造挑战(tedebark等人methods mol.biol.2011,683,505；kosuri,nat.methods 2014,11,499)。目前的合成方法通常利用20世纪80年代开发的四步骤固相亚磷酰胺方法(beaucage等人tetrahedronleft.1981,22,1859)。这种方法可以容易地实现自动化，并且适于合成修饰的dna结构。不幸的是，这种策略不适用大规模合成(>100kg)，并且目前仅限于<10kg批次的寡聚物产品(kim等人org.process res.dev.2016,20,1439)。目前使用直径至多1m且具有浅床(10-15cm)的柱进行千克级合成。增加柱尺寸会导致非线性流速并降低产品纯度，这意味着不可能强化合成，而是需要多个并列反应器。此类方法中使用的试剂对环境有害并且存在处理和处置问题。
5、目前还没有合理的在线反应监测方法，所述方法需要使用大量过量的昂贵的亚磷酰胺。这些单体含有多个保护基团(包括4'4-二甲氧基三苯甲基保护的5'-oh、苯甲酰基和异丙基保护的碱基、以及2-氰乙基保护的亚磷酸酯)，这进一步损害了原子效率并导致形成必须在合成期间分离的副产物。所述过程使用过大量的乙腈(每千克寡核苷酸1000千克)，并且需要对最终产品进行色谱纯化以去除由脱嘌呤、碱基修饰(由形成氰乙基加合物产生)和截短序列产生的杂质。由于现有合成方法的限制，目前市售的基于rna的治疗剂通常以约90％的纯度并作为非对映异构体的复杂混合物(由硫代磷酸酯修饰产生)提供，事实上，对单个立体异构体的生物活性的了解仍然非常有限。尽管最近开发了许多替代方法，包括使用p(v)试剂(knouse等人science 2018,361,1234)以及核苷酸结构单元与脱氧核苷酸基转移酶的共价键联(palluk等人nat.biotechnol.2018,36,645)，现有策略均具有在固体支持物上使用顺序偶联和脱保护反应的相同的基本方法。
6、因此，需要一种用于制造寡核苷酸，特别是治疗性寡核苷酸(诸如aso和mirna)的改进方法。
技术实现思路
1、本专利技术涉及一种合成寡核苷酸，例如治疗性寡核苷酸的方法。本专利技术旨在提供一种用于以低成本制造高纯度寡核苷酸的可扩展策略。以这种方式，本专利技术将寡核苷酸确立为可行的疾病治疗方法。本专利技术提供了一种方法，其中引物的延伸以及切割延伸的引物以释放寡核苷酸是同时进行的。引物-模板可以在反应或孵育阶段期间多次使用，从而催化寡核苷酸合成反应。
2、在第一方面，本专利技术提供了一种用于产生单链寡核苷酸的方法，所述方法包括：
3、i)提供引物-模板，其包含a)用于启动寡核苷酸合成的引物，b)指导寡核苷酸产物合成的模板，以及c)使寡核苷酸产物能够从模板释放的可切割位点；
4、ii)将引物-模板与核酸聚合酶、一种或多种dntp和切割剂一起孵育，以形成反应混合物；
5、iii)将反应混合物维持在允许以下的条件下：a)通过聚合酶延伸引物以形成延伸的引物-模板，和b)通过切割剂在可切割位点处切割延伸的引物-模板以提供寡核苷酸产物；
6、iv)任选地从反应混合物中分离寡核苷酸产物。
7、在第二方面，本专利技术提供了一种寡核苷酸，其通过第一方面的方法产生。
8、在第三方面，本专利技术提供了一种用于产生单链寡核苷酸的试剂盒，所述试剂盒包含：
9、i.引物-模板，其包含a)用于启动寡核苷酸合成的引物，b)指导寡核苷酸产物合成的模板，以及c)使寡核苷酸产物能够从模板释放的可切割位点；以及
10、ii.核酸聚合酶和任选地一种或多种核苷酸
11、iii.切割剂。
12、在第四方面，本专利技术提供了一种用于产生单链寡核苷酸的支持物，其包含固定在其上的引物-模板群体，其中每种引物-模板包含a)用于启动寡核苷酸合成的引物，b)指导寡核苷酸产物合成的模板，以及c)使寡核苷酸产物能够从模板释放的可切割位点。
13、在第五方面，提供了一种产生单链寡核苷酸群体的方法，所述方法包括：
14、i)提供引物-模板，其包含a)用于启动寡核苷酸合成的引物，b)指导寡核苷酸产物合成的模板，以及c)使寡核苷酸产物能够从模板释放的可切割位点；
15、ii)将引物-模板与核酸聚合酶、一种或多种dntp和切割剂一起孵育，以形成反应混合物；
16、iii)将反应混合物维持在本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于产生单链寡核苷酸的方法，所述方法包括：
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述聚合酶是如表3所示的来自Thermococcuskodakaraensis(KOD)、Stoffel家族B聚合酶9°N、丝状栖热菌(TfPol)和热液海洋嗜热菌(MhPol)的聚合酶；来自大肠杆菌的Klenow片段、T4和T7聚合酶、SFP1、Stoffel变体SFM4-6、来自丝状栖热菌和热液海洋嗜热菌(Mhpol)的Stoffel同源物、以及如表3所示的具有所列突变的任何前述聚合酶的变体。
3.一种产生单链寡核苷酸群体的方法，所述方法包括：
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述试剂基本上不包含乙腈。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述切割由核酸内切酶V介导，所述核酸内切酶优选来自海栖热袍菌的TmEndoV(TmEndoV)、来自新阿波罗栖热袍菌的TmEndoV、来自温泉假栖热袍菌的PtEndov、来自美热栖热腔菌的TmeEndoV以及来自大西洋栖热腔菌的TaEndoV；或其变体。
6.根据权利要求1
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中步骤iii)的所述反应条件包括等于或高于所述引物和延伸产物的解链温度的反应温度，并且优选地步骤iii)的所述反应条件是等温的。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述方法还包括一个或多个以下步骤：从所述模板解离寡核苷酸产物；从反应混合物分离所述寡核苷酸产物；以及纯化所述寡核苷酸产物。
9.一种用于产生单链寡核苷酸的试剂盒，所述试剂盒包含：
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其包含含有引物-模板的第一容器，以及含有核苷酸、聚合酶和/或缓冲液的第二容器或其他容器。
11.一种用于产生单链寡核苷酸的反应混合物，所述反应混合物包含引物-模板，所述引物-模板包含a)用于启动寡核苷酸合成的引物，b)指导寡核苷酸产物合成的模板，以及c)使所述寡核苷酸产物能够从所述模板释放的可切割位点；以及：
12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法、试剂盒、反应或支持物，其中所述切割位点是脱氨基碱基，优选肌苷。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法、试剂盒、反应或支持物，其中所述模板序列是治疗性RNA的互补序列。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法、试剂盒、反应或支持物，其中所述寡核苷酸产物是治疗性RNA，优选miRNA或反义寡核苷酸(ASO)或适体。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法、试剂盒、反应或支持物，其中所述寡核苷酸产物包含一种或多种修饰的核苷酸。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法、试剂盒、反应或支持物，其中所述聚合酶为如表3所定义的聚合酶或其变体；所述切割系统包含核酸内切酶V，并且所述切割位点是肌苷残基。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的方法、反应或试剂盒，其中所述核苷酸包含天然和/或修饰的核苷酸，并且其中修饰的核苷酸包括包含修饰的碱基、糖或核苷酸间键联的核苷酸，所述修饰的碱基、糖或核苷酸间键联例如硫代磷酸酯核苷酸间键联、5'-N-亚磷酰胺键联、含有允许标记附接的连接基团的碱基，所述标记诸如荧光团或半抗原。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的方法、试剂盒、反应或支持物，其中所述核酸分子包含固定部分，优选地其中所述固定部分是生物素。
19.一种用于产生单链寡核苷酸的支持物，其包含固定在其上的引物-模板群体，其中每种核酸分子包含a)用于启动寡核苷酸合成的引物，b)指导寡核苷酸产物合成的模板，以及c)使所述寡核苷酸产物能够从所述模板释放的可切割位点。
20.根据权利要求19所述的支持物，其中所述支持物是阵列，优选地其中所述阵列包含100、1000、10,000、100,000、1,000,000、10,000,000、100,000,000、1,000,000,000或更多个固定在其上的核酸分子。
21.一种寡核苷酸群体，其通过如权利要求1至20中任一项所述的方法产生。
22.根据权利要求21所述的寡核苷酸群体，其中所述群体的纯度为至少70％。
23.一种用于产生单链寡核苷酸的细胞，所述细胞包含引物-模板，所述引物-模板包含a)用于启动寡核苷酸合成的引物，b)...
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种用于产生单链寡核苷酸的方法，所述方法包括：
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述聚合酶是如表3所示的来自thermococcuskodakaraensis(kod)、stoffel家族b聚合酶9°n、丝状栖热菌(tfpol)和热液海洋嗜热菌(mhpol)的聚合酶；来自大肠杆菌的klenow片段、t4和t7聚合酶、sfp1、stoffel变体sfm4-6、来自丝状栖热菌和热液海洋嗜热菌(mhpol)的stoffel同源物、以及如表3所示的具有所列突变的任何前述聚合酶的变体。
3.一种产生单链寡核苷酸群体的方法，所述方法包括：
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述试剂基本上不包含乙腈。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述切割由核酸内切酶v介导，所述核酸内切酶优选来自海栖热袍菌的tmendov(tmendov)、来自新阿波罗栖热袍菌的tmendov、来自温泉假栖热袍菌的ptendov、来自美热栖热腔菌的tmeendov以及来自大西洋栖热腔菌的taendov；或其变体。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中步骤iii)中维持所述反应混合物的所述步骤包括将所述反应混合物维持一定的反应时间段，其中一定的反应时间段是允许在同一反应混合物内进行两个或更多个延伸和切割循环的持续时间。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中步骤iii)的所述反应条件包括等于或高于所述引物和延伸产物的解链温度的反应温度，并且优选地步骤iii)的所述反应条件是等温的。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述方法还包括一个或多个以下步骤：从所述模板解离寡核苷酸产物；从反应混合物分离所述寡核苷酸产物；以及纯化所述寡核苷酸产物。
9.一种用于产生单链寡核苷酸的试剂盒，所述试剂盒包含：
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其包含含有引物-模板的第一容器，以及含有核苷酸、聚合酶和/或缓冲液的第二容器或其他容器。
11.一种用于产生单链寡核苷酸的反应混合物，所述反应混合物包含引物-模板，所述引物-模板包含a)用于启动寡核苷酸合成的引物，b)指导寡核苷酸产物合成的模板，以及c)使所述寡核苷酸产物能够从所述模板释放的可切割位点；以及：
12.根据权利要求1至11中...
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