【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于微生物，涉及一种筛选和评估群体感应抑制剂的方法。
技术介绍
1、自1932年发现抗生素以来，抗生素被广泛应用于医院、农业、畜牧业和水产养殖。在过去90年里，人类对病原体的防控有了很大的突破。然而，随着抗生素的过度和不当使用，细菌已经产生了对多种药物的耐药性，使人类面临传染病的潜在风险增加。由于新抗生素的开发非常有限且耗时，其他替代试剂或技术，在过去十年中越来越受到关注，如噬菌体疗法、纳米颗粒、抗菌肽、疫苗、代谢重编程和群体感应抑制等。
2、群体感应(quorum sensing,qs)于20世纪70年代首次在费氏弧菌中发现，由自诱导物(ais)信号分子介导，是一种细菌交流机制。细菌分泌的ais浓度随着细胞密度的增加而增加。通常细菌可以根据ais的浓度监测自身或环境中其他细菌的数目。当细胞密度达到一定阈值时，可激活相关基因的表达，进而影响许多重要的生物过程，如信号通信、生物被膜形成、毒性和生物发光。qs分子有典型的积累，包括n-酰基高丝氨酸内酯(ahl)，自动诱导器2(ai-2)和自动诱导期肽(aip)。不同的细菌种类具有分泌一种或多个qs分子的能力，一些缺乏qs系统的细菌可以利用其他物种产生的qs分子来维持其生理功能。铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)是一种人畜共患病原体，可引起出血性败血症、水肿和肠道炎症。目前，该菌引起的感染严重加剧，而在医院和养殖业该菌对各种抗生素的耐药性普遍增强，给该病的预防和治疗带来了极大的困难。在铜绿假单胞菌中，qs系统主要依赖于luxi/r家族的同
3、群体感应抑制剂(qsis)或淬灭素是一种可以抑制qs分子或qs系统活性的小分子、多肽、抗体或核苷酸，最近因其能够降低对病原感染的毒性而受到关注。据报道，例如，丁香和月桂叶油脂的成分之一-丁香酚，与铜绿假单胞菌rhlr和lasr的qs受体竞争性结合，导致包括毒力因子基因在内的多个基因被压制。目前已知的qsis主要来自环境，一些天然物质，如海洋红藻delisea pulchra、海洋珊瑚eunicea knighti和大蒜中提取的溴化呋喃酮，显示出对病原感染的qsi活性。此外，有报道称由青霉菌分泌的青霉酸和棒曲霉素是对铜绿假单胞菌感染有效。除了天然来源的qsis，人工合成与qs分子竞争的自动诱导类似物也是一种可行的方法。例如，小分子v-06-018衍生物，它们是铜绿假单胞菌qs受体lasr的拮抗物，其效能比其他常用的lasr拮抗物高100倍。然而，这些方法是耗时、费力的。此外，人工合成中使用的化学分子可能会导致化学残留污染，造成生态/环境破坏。
4、噬菌体展示系统是一种高通量筛选技术，将一定长度的所有外源多肽显示在噬菌体载体表面，识别基因表达产物的组合并进行亲和筛选。其已广泛应用于各种生物和医学应用，如疫苗和免疫疗法的开发，抗体或药物治疗的开发等。最近，palliyil等人成功地从免疫抗体噬菌体展示文库中生产出了针对ahls的高敏感单克隆抗体(palliyil等人，2014)。然而，该方法使用的ahls需要先与牛血清白蛋白(bsa)偶联，这可能会影响ahl的自然结构。最重要的是，ahl的修饰需要很强的化学背景，并且因为它们的结构复杂，并不是所有的ahls都能被修饰。
技术实现思路
1、为解决上述技术问题，本专利技术的目的在于提供一种高效大通量的筛选细菌群体感应抑制剂的方法。
2、为达到上述目的，本专利技术提供了筛选细菌群体感应信号抑制剂的方法，包括以下步骤：
3、将铜绿假单胞菌分子的感应质粒转导入大肠杆菌，并接种到lb培养基中进行二次发酵，然后将发酵生长至对数生长中期的菌液与噬菌体混合，进行感染；
4、将感染后的混合液，添加到lb培养基平板上扩散，通过抑制生物发光的方法验证群体感应抑制剂功能，最后通过高通量测序获得特异群体感应抑制剂多肽序列。
5、在本专利技术的一实施例中，具体包括如下步骤：
6、将铜绿假单胞菌分子c4-ahl感应质粒psb536转导入大肠杆菌er2738菌株，获得er536菌株,从所述lb平板中挑取该er536菌株并接种到5ml的lb培养基中，37℃、250rpm振荡10小时，以2％接种量转接到lb培养基中，然后在200rpm条件下振荡至对数生长中期并以1:10000稀释于液体lb培养基中形成待用菌液。
7、在本专利技术的一实施例中，具体包括如下步骤：
8、将噬菌体取10μl稀释到90μl无菌水中，再分别将200μl的所述待用菌液与10μl已稀释的噬菌体混匀，在室温条件下孵育2-5min，制得预混液；吸取上述预混液加入3ml、45℃温浴已融化的含有10-30wt.％蔗糖、0.7wt.％琼脂粉的lb培养基中，迅速混匀并倒入含有浓度为20μg/ml四环素、100μg/ml氨苄青霉素、10μmc4-ahl、10-30wt.％蔗糖、1.5wt.％琼脂粉的iptg/x-gal lb培养基平板上；待上层琼脂充分凝固后，将所述lb培养基平板倒置放入37℃培养箱中静置培养12-16h。
9、在本专利技术的一实施例中，具体包括如下步骤：
10、利用化学发光成像技术，将所述静置培养后的lb培养基平板分别在自然可见光、白炽灯光和生物荧光光源下拍照比对，分析比较存在差异的噬菌斑个体。
11、在本专利技术的一实施例中，具体包括如下步骤：
12、选取在可见光中呈蓝色，白炽灯光中可见而在生物荧光中不发光或者明显变暗的克隆以及对照，在添加有lb液体培养基中培养，37℃、250rpm振荡12-16h；然后在添加有20μg/ml四环素、100μg/ml氨苄青霉素和10μmc4-ahl的iptg/x-gallb固体培养基上划线，37℃培养箱中静置培养12-16h，得到单克隆菌株；然后，将所述单克隆菌株失活后，用灭菌牙签挑取，高通量测序获得目标物。
13、在本专利技术的一实施例中，对采用高通量测序的阳性克隆株使用如下引物进行测序：
14、引物对1:f:ctagcgtttaaacttaagcttaagttttttaagttcttcaagttttttaag(seq idno:1)
15、r:cccttgctcaccatacaagaacgatacagaggcagct(seq id no:2)
16、引物对2:f:tcttgtatggtga本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种筛选细菌群体感应信号抑制剂的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，对采用高通量测序的阳性克隆株使用如下引物进行测序：
7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的IPTG/X-gal LB培养基为IPTG/X-gal LB琼脂培养基或IPTG/X-gal LB固体培养基，配方为：将1.25gIPTG、1gX-gal溶于25mL二甲基甲酰胺的母液按0.1％添加至已融化的含有1.5wt.％琼脂粉的LB培养基中。
8.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的LB培养基为LB培养基中添加0.7wt.％琼脂粉，LB培养基为5g酵母粉，10g蛋白胨，10g氯化钠，pH＝7.4-7.6，1000mL。
【技术特征摘要】
1.一种筛选细菌群体感应信号抑制剂的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，对采用高通量测序的阳性克隆株使用如下引物进行测序：
7.根...
【专利技术属性】
技术研发人员：周进，蔡中华，曾艳华，程珂珂，谢伟东，
申请(专利权)人：清华大学深圳国际研究生院，
类型：发明
国别省市：
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