一种定量检测猕猴桃溃疡病菌的实时荧光PCR方法技术

本发明专利技术公开一种定量检测猕猴桃溃疡病菌的实时荧光PCR方法，包括以下步骤：提取猕猴桃样品基因组DNA；电泳检测所述猕猴桃样品基因组DNA的条带大小和纯度；荧光定量检测PSA病原菌；基于特异性引物进行荧光定量PCR扩增，根据扩增曲线初步确定是否含有PSA病原菌；对有明显扩增峰的PCR产物纯化后进行测序；测序所得序列进行网上比对后进一步确定该PSA病原菌。本发明专利技术所述方法建立了该病原菌基于荧光定量PCR的快速检测方法，实现了猕猴桃溃疡病感病样本的快速鉴定；具有操作简单、灵敏性高和特异性强等特点，且检测结果准确、客观，对提高猕猴桃溃疡病感病样本的检测效率及灵敏度具有重要意义。

Real time fluorescence PCR method for quantitative detection of kiwifruit canker pathogen

The invention discloses a method of real-time PCR for quantitative detection of kiwifruit canker, which comprises the following steps: extraction of kiwifruit genomic DNA electrophoresis samples; the samples of kiwifruit genomic DNA band size and purity; fluorescence quantitative PSA detection of pathogenic bacteria; based on specific primers for PCR amplification, amplification curve according to preliminary determine whether PSA containing pathogen; PCR products have obvious peaks of amplification of purified DNA sequencing; sequence alignment online to further determine the pathogenic bacteria PSA. The method of the invention has established the pathogen rapid detection method based on fluorescence quantitative PCR, to achieve a rapid identification of kiwifruit canker disease samples; has the advantages of simple operation, high sensitivity and specificity, and the detection result is accurate and objective, has important significance to improve the detection efficiency and sensitivity of kiwifruit canker disease samples.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于植物病原检测
，具体涉及一种定量检测猕猴桃溃疡病菌的实时荧光PCR方法。
技术介绍
猕猴桃(Actinidiachinensis)是一种经济价值很高的水果，国内外均有大量种植。然而，近年来随着猕猴桃栽培面积不断增加，细菌性溃疡病快速蔓延，自2005年以来，已在世界主要猕猴桃产区造成严重危害，成为猕猴桃栽培过程中最具毁灭性的病害，严重威胁世界猕猴桃的生产安全。猕猴桃溃疡病是一种具有毁灭性的细菌性病害，最早于上世纪80年代早期在日本和美国被发现并作了较为详细的报道。随后，此病相继在韩国、伊朗、意大利等国出现。2008年开始，该病在欧洲境内大规模爆发，相继在法国、葡萄牙、西班牙、土耳其、瑞士等国发生。除此之外，该病在澳大利亚、新西兰等国也时有发生。在中国，该病最早发现于湖南东山峰农场，之后在较短的一段时间内便迅速蔓延至四川、安徽、福建等省，很多果园因死树率太高而迫使果农砍树毁园，损失惨重。溃疡病已成为猕猴桃生产的主要限制因素。随着我国猕猴桃进出口贸易的发展，猕猴桃溃荡病已被列为全国林业检疫性有害生物，检疫并控制该病的蔓延成为保障我国猕猴桃产业健康发展的重中之重。猕猴桃溃疡病主要危害植株新梢、枝干及叶片，引起枝梢枯死，叶片萎蔫；发病严重时甚至整株枯亡。该病通过病原菌侵染猕猴桃植株内部组织，可在其地面组织器官上产生明显的症状：枝干上，多从侧枝、嫩枝、芽眼、果柄等处开始发病。被害初期病斑呈水渍状，后逐渐扩大，颜色加深，致使皮层与木质部分离，呈松软状；随后病部皮层纵向龟裂，流出大量乳白色粘稠液体，后被氧化为红褐色；发病后期流胶处组织下陷，形成渗出白色或红褐色黏液的溃疡斑，最后致使发病枝干干枯死亡。叶片上，形成带黄晕的不规则暗褐色病斑，湿度大时病斑处有菌脓溢出，后期病斑变为黑色大斑，严重时致使叶片焦枯脱落。该病害一经发生将严重影响猕猴桃的产量和质量，造成严重的经济损失。近五年，根据生物学特性、16S和16S-23S(ITS)rDNA序列比对分析，新西兰、法国、西班牙等国都将猕猴桃溃疡病病原菌鉴定为丁香假单胞菌猕猴桃致病变种(Pseudomonassyringaepv.actinidae，PSA)。该病害传统的检疫方法多借助发病后的典型症状以及依靠分离病原对病害进行判别。这些方法不仅耗时且存在一定的局限性，因为该病害存在潜伏侵染现象，被害植株会在侵染发生一段时间后才表现出典型症状，此时再通过化学方法进行防治，远远达不到预期效果。因此，非常有必要建立一种能在病原菌侵染早期快速诊断病害的方法，以便有针对性地采取措施阻止病害进一步发生。实时荧光定量PCR(Real-timePCR)因其高灵敏度和特异性，越来越广泛地应用于植物病害的检测。建立猕猴桃溃疡病原菌实时荧光定量PCR检测方法，并验证其实际效果，这对于开展该病菌准确鉴定、早期诊断，进而有效防治猕猴桃溃疡病有着极其重要的意义。目前，实时荧光定量PCR方法用于检测该病原菌在国内尚未有专利报道。
技术实现思路
针对上述技术问题，本专利技术提供一种定量检测猕猴桃溃疡病菌的实时荧光PCR方法，实现了猕猴桃溃疡病感病样本的快速鉴定。本专利技术的技术方案如下：一种定量检测猕猴桃溃疡病菌的实时荧光PCR方法，包括以下步骤：步骤a、提取猕猴桃样品基因组DNA；电泳检测所述猕猴桃样品基因组DNA的条带大小和纯度；步骤b、荧光定量检测PSA病原菌；基于特异性引物进行荧光定量PCR扩增，根据扩增曲线初步确定是否含有PSA病原菌；步骤c、测序；对有明显扩增峰的PCR产物纯化后进行测序；所得序列进行网上比对后进一步确定该PSA病原菌。优选地，所述步骤a中采用植物基因组提取试剂盒提取疑似染病的猕猴桃枝条或叶片的猕猴桃样品基因组DNA，提取的所述猕猴桃样品基因组DNA条带采用微量核酸分析仪检测纯度。优选地，所述步骤b中的特异性引物包括上游引物P3F：5’-GGTTTCGGACACCGCAGGTTCTACCGAG-3’，以及下游引物P5R：5’-CTTCCTGATCCCCGTTACCCATCGAC-3’；所述步骤b中的荧光定量PCR扩增的反应体系为：上游引物和下游引物各0.5μL，SYBRPremixExTaqTM6.75μL，模板DNA0.5μL，ddH2O4.75μL；所述步骤b中的荧光定量PCR扩增的反应条件为：94℃3min；94℃10s，68℃15s，72℃30s，每循环延伸后检测荧光，共45个循环；72℃延伸10s；每个反应设置三次重复；在55～95℃内，每升高0.5℃检测荧光信号。优选地，所述步骤c中的测序的正向测序引物为P3F，反向测序引物为P5R。本专利技术的有益效果是：1、通过基因组提取、荧光定量扩增及分子测序等方法，实现了猕猴桃溃疡病感病样本的快速鉴定，建立了该病原菌基于荧光定量PCR的快速检测方法；2、具有操作简单、灵敏性高和特异性强等特点，且检测结果准确、客观，对提高猕猴桃溃疡病感病样本的检测效率及灵敏度具有重要意义；3、适用于准确检测猕猴桃枝条、叶片等组织中PSA病菌的早期诊断，预防受灾面积扩大，减少因此引起的经济损失；在进出口检疫中运用于此方法，也可大大提高检疫的速度和准确度，以控制猕猴桃溃疡病在我国的进一步蔓延。附图说明图1是本专利技术所述定量检测猕猴桃溃疡病菌的实时荧光PCR方法的流程图；图2是本专利技术所述定量检测猕猴桃溃疡病菌的实时荧光PCR方法的引物对P3F/P5R的荧光定量PCR特异性检测结果图；图3是本专利技术所述定量检测猕猴桃溃疡病菌的实时荧光PCR方法的引物对P3F/P5R的real-timePCR灵敏度检测结果图；图4是本专利技术所述定量检测猕猴桃溃疡病菌的实时荧光PCR方法的PSA致病菌基因组DNA的荧光定量PCR标准曲线图；图2中：1、染病枝条；2、PSA致病菌；3、健康枝条；4-13、10种其它菌；14、ddH2O；图3中：1、1ng/μLPSA致病菌基因组DNA；2、100pg/μLPSA致病菌基因组DNA；3、10pg/μLPSA致病菌基因组DNA；4、1pg/μLPSA致病菌基因组DNA；5、100fg/μLPSA致病菌基因组DNA；6、10fg/μLPSA致病菌基因组DNA；7、ddH2O。具体实施方式下面结合附图对本专利技术做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。如图所示，本专利技术公开一种定量检测猕猴桃溃疡病菌的实时荧光PCR方法，包括以下步骤：步骤a、提取猕猴桃样品基因组DNA；电泳检测所述猕猴桃样品基因组DNA的条带大小和纯度；所述步骤a中采用植物基因组提取试剂盒提取疑似染病的猕猴桃枝条或叶片的猕猴桃样品基因组DNA，提取的所述猕猴桃样品基因组DNA条带采用微量核酸分析仪检测纯度，用于步骤b中的荧光定量PCR扩增模板。步骤b、荧光定量检测PSA病原菌；基于特异性引物进行荧光定量PCR扩增，根据扩增曲线初步确定是否含有PSA病原菌；所述步骤b中的特异性引物包括上游引物P3F：5’-GGTTTCGGACACCGCAGGTTCTACCGAG-3’，以及下游引物P5R：5’-CTTCCTGATCCCCGTTACCCATCGAC-3’；所述步骤b中的荧光定量PCR扩增的反应体系为：上游引物和下游引物各O.5μ本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种定量检测猕猴桃溃疡病菌的实时荧光PCR方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤a、提取猕猴桃样品基因组DNA；电泳检测所述猕猴桃样品基因组DNA的条带大小和纯度；步骤b、荧光定量检测PSA病原菌；基于特异性引物进行荧光定量PCR扩增，根据扩增曲线初步确定是否含有PSA病原菌；步骤c、测序；对有明显扩增峰的PCR产物纯化后进行测序；测序所得序列进行网上比对后进一步确定该PSA病原菌。

【技术特征摘要】
1.一种定量检测猕猴桃溃疡病菌的实时荧光PCR方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤a、提取猕猴桃样品基因组DNA；电泳检测所述猕猴桃样品基因组DNA的条带大小和纯度；步骤b、荧光定量检测PSA病原菌；基于特异性引物进行荧光定量PCR扩增，根据扩增曲线初步确定是否含有PSA病原菌；步骤c、测序；对有明显扩增峰的PCR产物纯化后进行测序；测序所得序列进行网上比对后进一步确定该PSA病原菌。2.根据权利要求1所述的定量检测猕猴桃溃疡病菌的实时荧光PCR方法，其特征在于：所述步骤a中采用植物基因组提取试剂盒提取疑似染病的猕猴桃枝条或叶片的猕猴桃样品基因组DNA，提取的所述猕猴桃样品基因组DNA条带采用微量核酸分析仪检测纯度。3.根据权利要求1所述的定量检测猕猴桃溃疡病菌的实时荧光PCR方法，其特征在于：所述步骤b中的特异...

【专利技术属性】
技术研发人员：俞超，谢锦添，吴月燕，马立孟，
申请(专利权)人：浙江万里学院，
类型：发明
国别省市：浙江;33