一种检测牛流行热病毒的LAMP方法技术

本发明专利技术属于病原微生物检测技术领域，具体公开了一种检测牛流行热病毒的LAMP方法。本发明专利技术充分分析了牛流行热病毒基因序列，筛选出相对保守的基因片段，在保守的基因片段中设计了很多组引物对，最后经过逐一筛选发现，即使是在保守序列中设计的引物也不一定能够专一性的检测牛流行热病毒。最后，经过大量的引物筛选工作，发明专利技术人终于找到一组可专一性检测牛流行热病毒的LAMP引物。并以该引物建立了检测牛流行热病毒的LAMP方法，该方法灵敏性、特异性和稳定度都很好。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及病原微生物检测
，具体地，涉及一种检测牛流行热病毒的LAMP方法。
技术介绍
牛流行热俗称三日热或暂时热，是由牛流行热病毒引起的一种急性、热性传染病。 主要侵害奶牛，黄牛次之，水牛很少发生。该病以发病急、传播快、高热、呼吸道炎症、四肢关 节疼痛、行动僵拘等为主要特征。本病在我国主要见于南方，如广东、广西、云南、贵州、湖 南、湖北、江西、江苏等省区常发，尤其是夏末初秋、高温季节较多发生。目前，在北方地区也 时有本病的流行，给我国养牛业造成较大的经济损失。 -般根据牛流行病学特征，临床症状和病理变化的特点，可以对该病做出初步诊 断。需要确诊的，可以借助一些实验室检测手段来进行，如中和实验、补体结合、ELISA、间 接免疫荧光实验来检测血清中的特异性抗体，但大部分诊断技术程序繁琐，检测的效果也 不是很理想；另外也可以在发热初期采血进行病毒分离，或者用荧光定量PCR的方法检测 特异性抗原，但是，这些检测技术的灵敏性都不是很好，而且对实验条件和设备的要求比较 尚。
技术实现思路
本专利技术为了克服现有技术的上述不足，提供一种专一性检测牛流行热病毒的LAMP引物。 本专利技术的另一个目的是提供一种检测牛流行热病毒的LAMP试剂盒。 为了实现上述目的，本专利技术是通过以下方案予以实现的： 一种检测牛流行热病毒的LAMP引物，由外引物对F3/B3和内引物对FIP/BIP组成，弓丨 物的序列如SEQIDN0:l~4所示。 现有技术中已经存在很多检测其他病原物的LAMP引物，但是，对于牛流行热病毒 一直都没有，原因在于，牛流行热病毒（BEFV)和牛赤羽病病毒（AKV)、牛传染性支气管炎病 毒（IBRV)、牛病毒性腹泻病毒（BVDV)很相似，在检测的时候很容易出现交叉反应，所以，要 想设计一组专一性检测牛流行热病毒的LAMP引物非常的困难。本专利技术充分分析了牛流行 热病毒基因序列，筛选出相对保守的基因片段，在保守的基因片段中设计了很多组引物对， 最后经过逐一筛选发现，即使是在保守序列中设计的引物也不一定能够专一性的检测牛流 行热病毒。最后，经过大量的引物筛选工作，专利技术人终于找到一组可专一性检测牛流行热病 毒的LAMP引物。 如上所述检测牛流行热病毒的LAMP引物在制备牛流行热病毒检测试剂盒方面的 应用。 一种检测牛流行热病毒的LAMP试剂盒，包含一组LAMP引物，该引物由外引物对F3/B3和内引物对FIP/BIP组成，引物的序列如SEQIDN0:l~4所示。 优选地，检测牛流行热病毒的LAMP试剂盒的反应体系如下： BstDNAPolymerase1.0uL； lOXBuffer 2. 5uL； 病毒质粒 l.OyL; dNTPsMix(lOmM) 3. 0yL； MgS04 (lOOmM) 1. 0yL； 甜菜喊（5M) 5. 0yL； FIP/BIP 1. 6yM； F3/B3 0. 2yM； DEPC水 定容至25yL。优选地，检测牛流行热病毒的LAMP试剂盒的LAMP反应条件为64°C，反应60min， 86°〇灭活31^11，41：保存。 与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果： 本专利技术充分分析了牛流行热病毒基因序列，筛选出相对保守的基因片段，在保守的基 因片段中设计了很多组引物对，最后经过逐一筛选发现，即使是在保守序列中设计的引物 也不一定能够专一性的检测牛流行热病毒。最后，经过大量的引物筛选工作，专利技术人终于找 到一组可专一性检测牛流行热病毒的LAMP引物。并以该引物建立了检测牛流行热病毒的 LAMP方法，该方法灵敏性、特异性和稳定度都很好。【附图说明】 图 1 为温度对LAMP反应的影响；M:DL2000Marker;1 :60°C;2 :61°C;3 :62°C;4 : 63°C;5 :64°C;6 :65°C。 图2为内外引物比例对LAMP反应的影响；M:DL2000Marker;1 :0. 2yM(外)， 0. 2yM(内）；2:0.2yM(外），0.4yM(内）；3:0.2yM(外），0.8yM(内）；4:0.2yM(外），l.OyM(内）；5:0.2yM(外），1.2yM(内）；6:0.2yM(外），1.6yM(内）；7:0.2yM(外）， 1.8yM(内）；8:0.2yM(外)，2.0yM(内）；N:阴性对照。 图 3 为Mg2+浓度对LAMP反应的影响，M:DL2000Marker;1:lmM;2 :2mM;3 :3mM;4 : 4mM;5 :5mM;6 :7mM;N:阴性对照。 图 4 为dNTPsMix浓度对LAMP反应的影响；M:DL2000Marker; 1 :0? 8yM;2 : 1. 2yM;3 :1. 6yM;4 :2. 0yM;5 :2. 4yM;6 :2. 8yM;7 :3. 2yM;N:阴性对照。 图 5 为为甜菜碱浓度对LAMP反应的影响；M:DL2000Marker;1 :0. 4M;2 :0. 6M;3 : 0? 8M;4 :1. 0M;5 :1. 2M;6 :1. 4M;N:阴性对照。 图 6 为为反应时间对LAMP反应的影响；M:DL2000Marker;1 :10min;2 :20min;3 : 30min;4 :40min;5 :50min;6 :60min〇 图7为牛流行热阳性质粒LAMP扩增结果；M:DL2000Marker;1 :牛流行热阳性质 粒LAMP扩增条带。 图 8 为普通PCR扩增敏感性结果；M:DL2000Marker;1 :8. 5XlOSg/yL; 2 ：8. 5X10°ng/yL；3 ：8. 5X10_1ng/yL；4 ：8. 5X10_2ng/yL；5:8. 5X10_3ng/yL；6 ： 8. 5Xl(T4ng/yL〇 图 9 为LAMP扩增敏感性结果；M:DL2000Marker;1 :8. 5XlObg/yL;2 : 8. 5X10°ng/yL；3 ：8. 5X10_1ng/yL；4 ：8. 5X10_2ng/yL；5 ：8. 5X10_3ng/yL；6 ： 8. 5Xl(T4ng/yL〇 图 10 为BEFVLAMP反应特异性；M:DL2000Marker;1:BEFV;2:AKV(赤羽病病 毒）；3:IBRV(牛传染性鼻气管炎病毒）；4:BVDV(牛病毒性腹泻病毒）N:阴性对照。 图11为LAMP稳定性；M:DL2000Marker;1 :牛流行热阳性样品扩增条带；N:阴性 对照。【具体实施方式】 下面结合说明书附图和具体实施例对本专利技术作出进一步地详细阐述，所述实施例 只用于解释本专利技术，并非用于限定本专利技术的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特 殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂 和材料。 牛赤羽病病毒、牛病毒性腹泻病毒和牛传染性鼻气管炎病毒核酸由广东省检验检 疫技术中心动物检验室惠赠。 实施例1 一、LAMP引物的设计：本专利技术充分分析了牛流行热病毒基因序列（GenBank中已发表)， 筛选出相对保守的基因片段，在保守的基因片段中设计了很多组引物对，最后经过逐一筛 选发现，即使是在保守序列中设计的引物也不一定能够专一性的检测牛流行热病毒。最后， 本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测牛流行热病毒的LAMP引物，其特征在于，由外引物对F3/B3和内引物对FIP/BIP组成，引物的序列如SEQ ID NO：1~4所示。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李守军，韩太光，贾坤，远立国，孙凌霜，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东;44