一种一步法定量检测KRECs基因的实时荧光定量PCR试剂盒及应用制造技术

本发明专利技术涉及一种用于定量检测KRECs基因实时荧光定量PCR检测试剂盒及其应用。本发明专利技术包括一个以实时荧光PCR技术为基础的实时荧光定量PCR反应体系。荧光PCR反应体系包括针对KRECs和β-actin基因的正、反向引物和特异性荧光探针。该试剂盒可以快速地筛查新生儿免疫系统B细胞水平，具有高灵敏度和稳定性，以及非常好的重现性，此方法适用于KRECs的定量检测，能应用于新生儿免疫系统功能筛查，具有实际的临床应用价值。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于体外核酸诊断领域，涉及一种一步法定量检测K-删除重组切除环 (k-deletingrecombinationexcisioncircles，KRECs)基因的实时焚光定量聚合酶链 式反应（PolymeraseChainReaction，PCR)试剂盒及其应用。
技术介绍
原发性免疫缺陷病（PrimaryImmunodeficiencyDisease，PID)是一类因免疫 系统遗传缺陷或先天发育不全造成免疫功能障碍所致的免疫缺陷病，已发现超过200个病 种。PID常发生在婴幼儿期，可出现反复感染，严重的可威胁生命。其中有些可能获得有效的 治疗，因此及时诊断仍很重要。2008年美国CDC在美国威斯康辛州进行重症联合免疫缺陷 (SevereCombinedImmunodeficiencyDisease,SCID)新生儿筛查。从2009年起，美国马萨 诸塞州、路易斯安那州、纽约州、加利福利亚州、德克萨斯州、宾夕法尼亚州、密歇根州以及 波多黎各自由邦等陆续开展新生儿SCID筛查，已有超过21个州进行了新生儿SCID筛查。 在世界范围内，有美国、瑞典、德国、英国、法国、土耳其、日本、沙特阿拉伯、伊朗、中国香港 等多个国家和地区已开展PID筛查。其总发病率为：美国1/10000,澳大利亚2. 82/100000， 日本和瑞典1/5000,我国香港地区1/8000。目前国内缺乏全面的统计资料，如果按照相关 研究得出的PID总发病率1/10000估算，我国每年出生的2500万个新生儿中有2500个新 发的PID病例，整个儿童期累及病例达到3万-6万例。 按免疫缺陷性质的不同，原发性免疫缺陷病可分为特异性和非特异性两大类，其 中特异性PID占到80 %的比例。特异性PID包括体液免疫缺陷（即抗体缺乏为主的免疫 缺陷）、细胞免疫缺陷以及两者兼有的联合性免疫缺陷三大类。非特异性PID有补体缺陷、 吞噬细胞缺陷等。抗体缺乏为主的免疫缺陷病属于细胞免疫缺陷类，是由于B细胞早期发 育障碍引起的一组原发性免疫缺陷症，由于体液免疫缺陷，容易反复发生细菌感染，表现为 B细胞和免疫球蛋白不同程度的减少，是发病率最高的原发性免疫缺陷病。目前分为以下 几类：1)严重低丙球蛋白血症，致病原因有BTK基因缺陷、μ链缺乏、λ5链缺乏、Iga缺 乏、Igi3缺乏、B细胞连接蛋白（BLNK)缺乏、骨髓发育不良等，其中X连锁无丙种球蛋白血 症（XLA)是最常见的体液免疫缺陷症，其病因是Bruton酪氨酸激酶（Bruton'sTyrosine Kinase，BTK)缺陷，表现为B细胞和免疫球蛋白显著低下；2)血清IgG和IgA的重度减少 伴B细胞正常、减少或显著减少，致病原因有普通变异型免疫缺陷病（CommonVariable ImmunodeficiencyDisease，CVID)、可诱导共刺激分子（InducibleCo_Stimulator，IC0S) 缺陷、⑶19缺陷、X连锁淋巴组织增殖综合症（X-linkedLymphProliferativeDisease， XLP) ;3)血清IgG和IgA的重度减少，IgM正常或增高（高IgM综合症），致病原因有⑶40 配体缺陷、0)40缺陷、活化诱导胞啶脱氨基酶（Activation-inducedCytidineDeaminase， AICDA)缺陷、尿嘧啶N-糖基化酶（Uracil-N-Glycosylase，UNG)缺陷；4)同种型或轻链缺 乏，致病原因有Ig重链缺乏、κ链缺乏、选择性IgG亚类缺陷、选择性IgA缺陷等。抗体缺 乏为主的免疫缺陷病病因繁多，诊断非常困难，但共同特征是B淋巴细胞缺乏或不同程度 的减少。 目前XLA的检测一般通过流式细胞术检测⑶19+B细胞〈2%或者免疫球蛋白低于 相应年龄正常值2S以上的诊断指标，但这两种方法容易产生假阴性，特异性差。在研究中， 也采用检测BTK蛋白表达或者BTK基因突变的方法检测原发性免疫缺陷病，但这两种方法 容易产生假阳性，并且对技术要求高，仅在专科实验室研究，难以普及。 在B细胞成熟过程中，免疫球蛋白的λ链发生的基因重排时形成的κ-删除重组 切除环（K-deletingrecombinationexcisioncircles，KRECs)，KRECs也不随着细胞的 增殖而增加，而是不断被稀释。因为抗体缺乏为主的免疫缺陷病中的B细胞成熟缺陷发生 在κ-删除重组前，病人B细胞中KRECs缺乏或不同程度的减少，利用定量PCR法检测KRECs 可以作为抗体缺乏为主的免疫缺陷病的新生儿筛查方法，因此通过对KRECs的定量测定可 以筛查出患有B细胞成熟缺陷的新生儿。 申请号为201210473717. 9的中国专利提供了一种定量检测KRECs基因的实时荧 光定量PCR试剂盒及应用。该专利包括一个以巢式PCR技术为基础的PCR反应体系和以实 时荧光PCR技术为基础的实时（Realtime)荧光定量PCR反应体系。该KRECs基因检测方 法为两步法。相对于基因组DNA，由于KRECs为人类基因组发育重排过程中切割下来的环状 基因，含量极低，因此两步法在DNA提取之后，采用第一轮巢式PCR扩增和第二轮荧光实时 定量PCR扩增共两轮扩增，极大地提升了KRECs基因DNA含量，以此达到减少假阴性结果， 提尚特异性的目的。 然而，上述专利采用包括巢式PCR扩增和实时荧光定量PCR扩增的两步法，操作复 杂繁琐、耗时长，关键的是，所用DNA提取方法提取的DNA丰度不够且纯度不高、巢式PCR带 来扩增误差、巢式PCR之后的移液操作带来样品污染，诸多环节累计的误差最终导致漏检 的可能性大。在新筛过程中如发生漏检，患儿将错过最佳诊断及治疗时机。 针对上述问题，尤其是两步法漏检临界阳性样本可能性较大的问题，本专利技术的目 的在于提供一种能减少扩增误差和样品污染，具有更高灵敏度和特异度，同时操作简便快 速的一步法KRECs基因检测试剂盒来填补国内这一空白。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种灵敏度和特异度更高且快速简便的通过定量检测 KRECs基因拷贝数，用来筛查新生儿原发性B细胞免疫缺陷的实时荧光定量PCR试剂盒，该 试剂盒适用于目前市场上所有类型的荧光定量PCR扩增仪。本专利技术能够检测新生儿B细胞 的水平，判断新生儿免疫系统功能是否正常，在临床检验领域有良好的应用前景。 本专利技术的另一个目的是在于提供一种筛查新生儿B细胞免疫缺陷中的应用，上述 试剂盒所需的样本获取、运输、储存方便，灵敏度和特异性高，检测方法简便、快速，实验结 果准确可靠。 为了实现上述目的，本专利技术提供： -种一步法定量检测KRECs基因的实时荧光定量PCR试剂盒，该试剂盒其中包括 DNA提取液、包含KRECs基因插入序列的标准品I、包含β-actin基因插入序列的标准品 II、包含KRECs基因的实时荧光引物和探针的荧光PCR反应液I和包含β-actin基因的实 时荧光引物和探针的荧光PCR反应液II。 在本专利技术的一个方案中，荧光PCR反应液I是由KRECs荧光PCR引物和探针、 2. 5XrealtimeMix、BSA、20XPCREnhancer和无菌的超纯水组成。在本专利技术本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种一步法定量检测KRECs基因的实时荧光定量PCR试剂盒，其中包括：DNA提取液、包含KRECs基因插入序列的标准品I、包含β‑actin基因插入序列的标准品II、包含KRECs基因的实时荧光引物和探针的荧光PCR反应液I和包含β‑actin基因的实时荧光引物和探针的荧光PCR反应液II。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王晓川，王牧，李芳序，刘丹如，
申请(专利权)人：上海领检科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31