【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分子诊断领域，特别是涉及一种纳米金微球复合物及其制备方法和用途。
技术介绍
1、免疫pcr(immuno pcr,im-pcr)是利用抗原抗体反应的特异性和pcr(聚合酶链式反应)扩增反应的极高灵敏性而建立的一种微量抗原的检测技术。免疫pcr主要由两个部分组成，第一部分的免疫反应类似于普通的酶联免疫吸附试验(elisa)的测定过程；第二部分即通常的pcr扩增系统，其与一般pcr一样，主要包括引物、缓冲液和耐热dna聚合酶，而抗原分子的量则最终由pcr扩增产物的多少来反映。比如，第一步中，首先用待测抗原(如牛血清白蛋白(bsa))包被微孔板，再加入能和其反应的特异性抗体，于是抗体就与固相上的抗原结合形成抗原抗体复合物，其中的抗体igg再与蛋白a-链霉亲合素(protein a-streptavidin)嵌合体(重组融合蛋白)中的蛋白a部分结合，而链霉亲合素部分则与生物素化的dna中的生物素特异性反应，从而将特定的dna(脱氧核糖核酸)间接吸附于固相；第二步中的pcr过程，第一步中吸附于固相的dna可在相应的特异性引物存在下，经pcr扩增在短时间内放大数百万倍，由于pcr产物的多少与固相上抗原的量成正比，因此可以通过定量pcr来定量检测抗原量。pcr检测技术理论上只要有一条目标dna，就可以通过扩增检测出来，所以将其与免疫检测方法相结合，可以实现更高的检测灵敏度。
2、纳米金(au)，指的是金的微小颗粒，是迄今为止应用最广泛的颗粒，它的直径在1-100nm，外表有高电子密度、具有介电特性与催化的作用，可将a
3、目前球形核酸的制备方法有很多缺点，(1)使用巯基修饰的dna通过金硫键特异性吸附于au表面，但没有巯基的dna链其实也可通过氢键非特异性吸附到au表面，而趴于au表面的dna链会降低au表面的dna的标记量(见图2)；(2)两者混合产生的静电排斥作用会使这个吸附过程非常缓慢，有文献报道通过添加氯化钠盐，屏蔽两者间的负电荷，从而促进吸附过程，可是当au表面电荷被屏蔽后则易发生au的不可逆聚集，因此必须小心地控制盐的添加量，确保dna吸附动力学速度比au的聚合动力学快，时间也大概需要1-3天。
技术实现思路
1、鉴于以上所述现有技术的缺点，本专利技术的目的在于提供一种纳米金微球复合物及其制备方法和用途，用于提高免疫pcr检测技术的灵敏度。
2、为实现上述目的及其他相关目的，本专利技术提供一种纳米金微球复合物，所述纳米金微球复合物为表面直接或间接附着有亲和素、生物素、多肽和寡核苷酸的纳米金。
3、优选地，所述多肽和所述亲和素附着于所述纳米金表面，所述亲和素连接所述生物素，所述生物素连接所述寡核苷酸。
4、本专利技术还提供前述纳米金微球复合物的制备方法，所述制备方法包含如下步骤：
5、1)将交联剂和纳米金混合，活化纳米金；
6、2)将亲和素和步骤1)中活化后的纳米金混合，获得负载亲和素的纳米金；
7、3)将多肽和步骤2)中清洗后负载亲和素的纳米金混合，获得负载亲和素和多肽的纳米金；
8、4)将生物素修饰的寡核苷酸和步骤3)中负载亲和素和多肽的纳米金混合，与封闭液混合封闭，获得所述纳米金微球复合物。
9、本专利技术还提供前述纳米金微球复合物在制备免疫pcr产品中的用途。
10、本专利技术还提供一种检测试剂盒，所述检测试剂盒包含前述纳米金微球复合物。
11、本专利技术还提供一种免疫pcr检测方法，所述免疫pcr检测方法包含如下步骤：
12、i)将样品与偶联有和样品特异性结合的抗体的磁珠混合，分离磁珠；
13、ii)将前述纳米金微球复合物与步骤i)中清洗后分离的磁珠混合，分离磁珠；
14、iii)将步骤ii)中清洗后分离的磁珠，进行荧光定量pcr反应，通过荧光信号检测样品的含量。
15、如上所述，本专利技术的一种纳米金微球复合物及其制备方法和用途，具有以下有益效果：
16、本专利技术提供的纳米金微球复合物上的dna数量更高，通过纳米金微球复合物进行免疫反应，再通过荧光定量pcr法扩增dna并检测荧光信号来间接检测待测蛋白的含量，因此可实现更高灵敏度的免疫pcr检测方法；本专利技术可使样品的检测灵敏度达到飞克级别(fg/ml)，为临床诊断提供更好的技术支持；可以为其他试剂盒的开发提供一种高灵敏度、高特异性的检测方法。
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1.一种纳米金微球复合物，其特征在于，所述纳米金微球复合物为表面直接或间接附着有亲和素、生物素、多肽和寡核苷酸的纳米金。
2.根据权利要求1所述的纳米金微球复合物，其特征在于，所述多肽和所述亲和素附着于所述纳米金表面，所述亲和素连接所述生物素，所述生物素连接所述寡核苷酸。
3.根据权利要求1所述的纳米金微球复合物，其特征在于，所述纳米金微球还包含如下特征中的一项或多项：
4.根据权利要求3所述的纳米金微球复合物，其特征在于，所述寡核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
5.如权利要求1-4任一所述纳米金微球复合物的制备方法，其特征在于，所述制备方法包含如下步骤：
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，还包含如下特征中一项或多项：
7.如权利要求1-4任一所述的纳米金微球复合物在制备免疫PCR产品中的用途。
8.一种检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包含如权利要求1-4任一所述的纳米金微球复合物。
9.一种免疫PCR检测方法，其特征在于，所述免疫PCR检测方法包含如
10.根据权利要求9所述的免疫PCR检测方法，其特征在于，免疫PCR检测方法还包含如下特征中的一种或多种：
...【技术特征摘要】
1.一种纳米金微球复合物，其特征在于，所述纳米金微球复合物为表面直接或间接附着有亲和素、生物素、多肽和寡核苷酸的纳米金。
2.根据权利要求1所述的纳米金微球复合物，其特征在于，所述多肽和所述亲和素附着于所述纳米金表面，所述亲和素连接所述生物素，所述生物素连接所述寡核苷酸。
3.根据权利要求1所述的纳米金微球复合物，其特征在于，所述纳米金微球还包含如下特征中的一项或多项：
4.根据权利要求3所述的纳米金微球复合物，其特征在于，所述寡核苷酸的核苷酸序列如seq id no.1所示。
5.如权利要求1-4任一所述纳...
【专利技术属性】
技术研发人员：陶永辉，屠蔷，刘袁杰，王牧，
申请(专利权)人：上海领检科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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