一种荧光定量PCR检测鲤鱼糖代谢基因PEPCK和GK的检测引物及其检测方法和应用，它涉及一种糖代谢基因PEPCK和GK的检测引物及其检测方法和应用。本发明专利技术要解决现有鲤鱼糖代谢相关基因PEPCK和GK的方法存在成本高、灵敏度差，且目前鲤鱼饲料中蛋白质加入量很大，导致成本过高以及污染水体的问题。本发明专利技术的引物用于检测鲤鱼糖代谢相关基因PEPCK和GK。本发明专利技术的引物检测方法具有方便、通用、便宜的优点，解决了从基因水平上检测糖代谢相关基因表达调控的方法。
【技术实现步骤摘要】
-种荧光定量PCR检测鲤鱼糖代谢基因 PEPCK和GK的检测 引物及其检测方法和应用
本专利技术涉及一种鲤鱼糖代谢基因 PEPCK和GK的检测引物及其检测方法和应用。
技术介绍
糖代谢酶基因 PEPCK和GK，分别是糖代谢中糖异生和糖酵解中的关键酶基因，在 调节糖的代谢中起重要的作用。鲤鱼是我国大宗淡水养殖中的重要经济鱼类，研究鲤鱼对 糖的利用，不但可以降低蛋白质的利用，减少饲料成本，同时可以降低对水体氮磷的排放， 减少污染。目前，国外对鱼类糖代谢的研究，多数集中在虹鳟等冷水性鱼类，国内对鱼类糖 代谢相关酶的研究，多数停留在酶的活性检测，对于基因的调控上的研究很少，尤其对于鲤 鱼糖代谢酶基因 PEPCK和GK基因的荧光定量PCR方法上，尚属空白，这限制了对鲤鱼糖代 谢的研究工作。 由于鱼类品种繁多，基因的保守性不高，而荧光定量PCR的引物需要高度的特异 性，因此现有的关于PEPCK和GK基因的虹鳟等鱼的荧光定量PCR引物不适用于鲤鱼。 现有的研究基因表达差异的方法，存在成本高（芯片法）；灵敏度差（半定量PCR 法）等缺点。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了解决现有鲤鱼糖代谢相关基因 PEPCK和GK的方法存在成本 高、灵敏度差，且目前鲤鱼饲料中蛋白质加入量很大，导致成本过高以及污染水体的问题。 同时本专利技术也为了解决现在没有一种有效引物检测鲤鱼糖代谢相关基因 PEPCK 和GK的变化情况，进而有效控制鲤鱼饲料中加入糖的量替代饲料中的蛋白质加入量，而又 不影响鲤鱼的生长状态。 本专利技术的一种荧光定量PCR检测鲤鱼糖代谢基因 PEPCK和GK的检测引物，其引物 对如下： PEPCK-Fl :5' -AGGCTGGACGGTTGAGTGT-3' PEPCK-Rl :5' -GTGTTCCTGGAGATGGTTGC-3' ； 所述的检测鲤鱼糖代谢相关基因 GK引物对如下： GK-F2 :5，-TGCTGCCCACTTATGTCCG-3' GK-R2 :5, -TTCATCCTCACCCACTTTCA-3' 。 本专利技术的一种荧光定量PCR检测鲤鱼糖代谢基因 PEPCK和GK的检测引物的应用， 它用于检测鲤鱼糖代谢相关基因 PEPCK和GK。 本专利技术的一种荧光定量PCR检测鲤鱼糖代谢基因 PEPCK和GK的检测方法，它是按 照以下步骤进行的：将经过含糖饲料喂食后的鲤鱼，提取其肝脏组织RNA，然后将RNA反转 录成cDNA，以cDNA为模板，利用权利要求1的引物进行荧光定量PCR反应，即完成所述的检 测方法。 本专利技术包含以下有益效果： 1、本专利技术提供一种SYBR Green荧光定量PCR法检测鲤鱼糖代谢相关基因 PEPCK 和GK基因的特异性引物和检测方法，该方法具有简便易行、检测成本低、特异性好、灵敏度 和自动化程度高等优点，解决了从基因水平上检测糖代谢相关基因表达调控的方法。本发 明的引物特异性强，不会受到其他基因的干扰，为研究鲤鱼糖代谢机制及其他因素对其影 响提供了有效工具。 简便：本方法所使用的SYBR Green I是一种特异结合双链的DNA染料，与DNA结 合后荧光增强1000倍左右，灵敏度高，高于EB染色法25-100倍，至少可以检出20pg DNA， 通用性好，使用简单，价格相对低。 快速：PCR只需要40个循环左右即大约1个小时左右就可以完成反应，因而利用 荧光定量PCR检测基因表达变化是一种比较节省时间、快速的方法。 2、本专利技术设计的引物没有引物二聚体，没有非特异性扩增产物，符合荧光定量引 物设计要求，退火温度均在85°C左右。 3、引物的应用：利用设计的PEPCK和GK引物，检测不同糖及糖水平下鲤鱼肝脏组 织中该基因表达量变化差异，结果显示，GK基因表达水平随糖水平的增加而显著增加，且高 淀粉组的表达量显著高于高葡萄糖组。PEPCK基因在葡萄糖饲料中的表达水平高于淀粉组， 但不随糖水平的变化而变化。从而为减少鲤鱼饲料中的蛋白含量，增加糖的含量提供了依 据。 【附图说明】 图1为实施例1的PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测电泳图；其中，1为鲤鱼糖代谢基 因 GK的电泳图；2 :鲤鱼糖代谢基因 PEPCK的电泳图；3为DL 2000Marker ; 图2为鲤鱼糖代谢基因 PEPCK的荧光定量PCR扩增曲线； 图3为鲤鱼糖代谢基因 GK的荧光定量PCR扩增曲线； 图4为鲤鱼糖代谢基因 PEPCK的溶解性曲线； 图5为鲤鱼糖代谢基因 GK的溶解性曲线； 图6为不同糖及糖水平饲养鲤鱼肝脏组织中PEPCK基因表达差异图； 图7为不同糖及糖水平饲养鲤鱼肝脏组织中GK基因表达差异图。 【具体实施方式】 【具体实施方式】 一：本实施方式的一种荧光定量PCR检测鲤鱼糖代谢基因 PEPCK和 GK的检测引物，其引物对如下： PEPCK-Fl :5, -AGGCTGGACGGTTGAGTGT-3， PEPCK-Rl :5, -GTGTTCCTGGAGATGGTTGC-3,； 所述的检测鲤鱼糖代谢相关基因 GK引物对如下： GK-F2 :5, -TGCTGCCCACTTATGTCCG-3' GK-R2 :5, -TTCATCCTCACCCACTTTCA-3' 。 本实施方式的引物是根据鲤鱼糖代谢相关基因在Genbank上的序列号： PEPCK(AF427865. 1)和 GK(AF053332. 2)，通过 primer 5. 0 软件设计荧光定量 PCR 的引物。 【具体实施方式】 二：本实施方式的一种荧光定量PCR检测鲤鱼糖代谢基因 PEPCK和 GK的检测引物的应用，它用于检测鲤鱼糖代谢相关基因 PEPCK和GK。 【具体实施方式】 三：本实施方式与二不同点在于：检测鲤鱼糖代谢相 关基因 PEPCK和GK的过程如下：将经过含糖饲料喂食后的鲤鱼，提取其肝脏组织RNA，然后 将RNA反转录成cDNA，以cDNA为模板，利用一的引物进行荧光定量PCR反应， 即完成检测。其与二相同。 【具体实施方式】 四：本实施方式与二或三不同点在于：经过含糖饲料 喂食后的鲤鱼是指：将含糖饲料中的糖按梯度配制成所述的含糖饲料，然后将其饲喂鲤鱼。 其与二或三相同。 【具体实施方式】 五：本实施方式与二至四之一不同点在于：所述的糖 的梯度含量是指以25%为基础，按照1 %的梯度差逐级递增至50%。其它与 二至四之一相同。 【具体实施方式】 六：本实施方式与二至五之一不同点在于：所述的糖 为淀粉或葡萄糖。其它与二至五之一相同。 【具体实施方式】 七：本实施方式与二至六之一不同点在于：所述的淀 粉在饲料中的含量为50%。其它与二至六之一相同。 【具体实施方式】 八：本实施方式与二至七之一不同点在于：所述的葡 萄糖在饲料中的含量为50%。其它与二至七之一相同。 【具体实施方式】 九：本实施方式的一种荧光定量PCR检测鲤鱼糖代谢基因 PEPCK和 GK的检测方法，它是按照以下步骤进行的：将经过含糖饲料喂食后的鲤鱼，提取其肝脏组 织RNA，然后将RNA反转本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种荧光定量PCR检测鲤鱼糖代谢基因PEPCK和GK的检测引物，其特征在于所述的检测鲤鱼糖代谢相关基因PEPCK引物对如下：PEPCK‑F1：5’‑AGGCTGGACGGTTGAGTGT‑3’，PEPCK‑R1：5’‑GTGTTCCTGGAGATGGTTGC‑3’；所述的检测鲤鱼糖代谢相关基因GK引物对如下：GK‑F2：5’‑TGCTGCCCACTTATGTCCG‑3'，GK‑R2：5’‑TTCATCCTCACCCACTTTCA‑3'。
【技术特征摘要】
1. 一种荧光定量PCR检测鲤鱼糖代谢基因 PEPCK和GK的检测引物，其特征在于所述的 检测鲤鱼糖代谢相关基因 PEPCK引物对如下： PEPCK-Fl :5' -AGGCTGGACGGTTGAGTGT-3'，PEPCK-Rl :5' -GTGTTCCTGGAGATGGTTGC-3' ； 所述的检测鲤鱼糖代谢相关基因 GK引物对如下：GK-F2 : 5' -TGCTGCCCACTTATGTCCG-3'，GK-R2 :5' -TTCATCCTCACCCACTTTCA-3'。2. -种荧光定量PCR检测鲤鱼糖代谢基因 PEPCK和GK的检测引物的应用，其特征在于 它用于检测鲤鱼糖代谢相关基因 PEPCK和GK。3. -种荧光定量PCR检测鲤鱼糖代谢基因 PEPCK和GK的检测方法，其特征在于它是按 照以下步骤进行的：将经过含糖饲料喂食后的鲤鱼，提取其肝脏组织RNA，然后将RNA反转 录成cDNA，以cDNA为...
【专利技术属性】
技术研发人员：李晋南，徐奇友，王常安，王连生，赵志刚，罗亮，都雪，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院黑龙江水产研究所，
类型：发明
国别省市：黑龙江;23
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