一种鸭的TLR3基因的荧光定量PCR检测方法技术

本发明专利技术提供了一种鸭的TLR3基因的荧光定量PCR检测方法，所述检测方法包括：以重组质粒pEASY-T5-TLR3为模板，筛选引物的最佳浓度、荧光定量PCR反应体系及反应条件；以所述重组质粒为标准品，测定其OD260值；根据其分子量与质量浓度，计算拷贝浓度，稀释，FQ-PCR扩增，以所述重组质粒拷贝数的对数为X轴，循环次数为Y轴，建立标准曲线；对1.0×103～108拷贝/μL的重组质粒进行重复验证；以重组质粒为模板进行FQ-PCR检测；通过样品与所述标准品的序列比对及样品的溶解曲线的峰型对检测方法的特异性进行双重验证。

【技术实现步骤摘要】
一种鸭的TLR3基因的荧光定量PCR检测方法
本专利技术涉及一种鸭的TLR3基因的荧光定量PCR检测方法，属生命科学领域。
技术介绍
Toll样受体(Toll-likereceptors,TLRs)是一类进化上保守的Ⅰ型跨膜受体，包括富含亮氨酸(LeucineRichRepeats，LRRs)的胞外区、跨膜区和胞内TIR区(Toll/interleukin-1receptor)。作为先天性免疫在防御微生物感染的第一道防线，TLRs在检测病原相关分子模式(Pathogen-associatedmolecularpatterns,PAMPs)方面起重要作用，最终激活适应性免疫应答。TLR3可识别双链RNA(dsRNA)，通过非MyD88依赖的信号通路途径，结合TRIF介导下游信号转导，激活IRF-3和核因子κB(nuclearfactorkappa-B,NF-κB)，刺激诱导大量IFN-α/β及其他细胞因子的表达，分泌的干扰素能够抑制病毒的复制，从而达到抗病毒功能。相对于哺乳动物的Toll样受体，禽类的Toll样受体研究较为缓慢，目前关于鸭TLR3研究，Jiao等对番鸭TLR3有报道。传统的RT-PCR是半定量方法，在检测基因表达量方面精确度不高。YulinQi等运用半定量的方法检测鹅TLR3的组织分布，用β-actin作为对照发现法氏囊的表达量最高。Guo等建立了半定量RT-PCR方法来检测TLRs在牛单核细胞和单核巨噬细胞中的分布和表达规律。以上方法要么检测物种宽泛，要么检测敏感性不高。国内尚未见有关应用荧光定量PCR技术检测北京鸭TLR3的方法报道，并且本实验首次从鸭外周血单核细胞中克隆了北京鸭的TLR3基因。为研究鸭的TLR3在鸭发病过程中作用及表达水平变化，急需建立一种有效的检测方法。本实验建立的方法具有高敏感性、高特异性，高稳定性，且相比TaqMan探针法来说，价格便宜，灵敏度也较探针法高(见附图6)。本实验建立的方法可应用于分子生物学和生命科学研究领域。目前将荧光定量PCR方法应用于检测北京鸭TLR3基因的方法未见有报道。
技术实现思路
针对现有技术中的缺陷，本专利技术的目的是提供一种鸭的TLR3基因的荧光定量PCR检测方法。本专利技术是通过以下技术方案实现的：第一方面，本专利技术提供一种用于鸭的TLR3基因的荧光定量PCR检测的重组质粒pEASY-T5-zero-TLR3。优选地，所述重组质粒的标准品的纯度：OD260/280值为1.8～2.0；低于该1.8说明标准品有蛋白污染，高于2.0说明存在DNA存在降解现象。优选地，所述重组质粒pEASY-T5-zero-TLR3的构建是将TLR3基因PCR扩增产物克隆于pEASY-T5-Zero载体中实现的。第二方面，本专利技术提供一种用于鸭的TLR3基因的荧光定量PCR检测的引物，所述引物的序列如SEQIDNo.3、SEQIDNo.4所示。SEQIDNo.3引物大小为20bp，结合于鸭TLR3开放阅读框的201位到220位；SEQIDNo.4引物大小为20bp，结合于鸭TLR3开放阅读框的420位到439位。第三方面，本专利技术提供一种鸭的TLR3基因的荧光定量PCR检测方法，所述检测方法包括如下步骤：步骤一、荧光定量PCR反应体系及条件的优化：以所述重组质粒pEASY-T5-zero-TLR3为模板，采用矩阵法筛选所述引物的最佳浓度，并对荧光定量PCR反应体系及反应条件进行优化；步骤二、TLR3标准曲线的建立：以重组质粒pEASY-T5-duTLR3为标准品，测定其OD260值；根据所述标准品的分子量与质量浓度，计算其拷贝浓度，稀释，进行FQ-PCR扩增，以重组质粒pEASY-T5-duTLR3拷贝数的对数为X轴，循环次数(Ct)为Y轴，建立标准曲线；步骤三、重复性验证：对1.0×103～108拷贝/μL的重组质粒pEASY-T5-TLR3进行重复验证，每次重复设若干浓度梯度，每个浓度梯度设有若干平行处理；步骤四、敏感性验证：以重组质粒pEASY-T5-TLR3为模板进行FQ-PCR检测，同时设立阴性对照(NTC)；步骤五、特异性验证：通过样品与所述标准品的序列比对及样品的溶解曲线的峰型对检测方法的特异性进行双重验证。优选地，步骤一中，所述重组质粒pEASY-T5-TLR3中TLR3的PCR扩增引物的序列如SEQIDNo.1、SEQIDNo.2所示。优选地，步骤一中，所述荧光定量PCR反应体系为20μl，其中qPCRMasterMix10μL，P3、P4分别1μL，终浓度各为0.5μM，cDNA模板2μL，去离子水补足至20μL。优选地，步骤一中，所述反应条件为采用两步法PCR：预变性95℃2min；95℃15s、60℃1min，40个循环；溶解曲线条件：95℃15s；60℃15s；梯度递增升温至95℃，20min；95℃15s。所述步骤一还设有无重组质粒pEASY-T5-TLR3为模板的阴性对照(NTC)。优选地，步骤二中，所述FQ-PCR扩增的模板浓度为1.0×102～1.0×108拷贝/μL。优选地，步骤二中，所述FQ-PCR扩增的模板量为1.0×102～1.0×108拷贝。优选地，步骤四中，所述重组质粒pEASY-T5-TLR3的浓度为1.0×101～1.0×105拷贝/μL。优选地，步骤五中，所述样品选自鸭的肝、心、脾、肺、肾、食道、气管、腺胃、肌胃、胰腺、十二指肠、空肠、盲肠、法氏囊、胸腺、哈氏腺、脑、皮肤、肌肉以及骨髓。优选地，步骤五中，所述鸭为健康的北京鸭(Anasplatyrhynchos)。优选地，所述鸭的TLR3基因的荧光定量PCR检测方法还包括对样品和β-actin内参基因的循环阈值(Ct值)进行2-ΔΔCt处理；所述样品即为步骤五中样品。优选地，所述β-actin内参基因PCR扩增引物及定量引物均如序列SEQIDNo.5、SEQIDNo.6所示。染料与DNA双链结合时在激发光光源的照射下发出荧光信号，其信号强度代表双链DNA分子的数量。不掺入DNA双链中的染料不会被激发出任何荧光信号。qPCRMasterMix是用于实时定量PCR(qPCR和RT-qPCR)的新型试剂系统。该试剂系统包含一种新的DNA结合荧光染料(BRYT绿色染料)，该染料与双链DNA结合后，能够产生强度高于GreenI的荧光,通过检测反应体系中的BRYT绿色染料的荧光强度，达到检测PCR产物扩增量的目的。对于一个理想的PCR反应：Xn＝X0×2n对于一个非理想的PCR反应：Xn＝X0×(1+Ex)n式中，n为扩增反应的循环数；Xn为第n次循环后的产物；X0为初始模板量；Ex为扩增效率。在实时荧光定量PCR反应中，在扩增产物达到阈值时：XCt＝X0(1+Ex)Ct＝N式中，XCt为荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量。在阈值线设定以后，XCt是一个常数，我们将将其设定为N。两边同时取对数，得：lgN＝lg[X0(1+Ex)Ct]整理此式，得：LgX0＝-lg(1+Ex)×Ct+lgN对于每一个特定的PCR反应来说，Ex和N均是常数，所以Ct值与lgX0成负相关，也就是说，初始模板量的对数值与循环数Ct值成线性关系，初始模板量越多，扩增产物达到阈值时所需的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于鸭的TLR3基因的荧光定量PCR检测的重组质粒pEASY‑T5‑zero‑TLR3。

【技术特征摘要】
1.一种用于鸭的TLR3基因的荧光定量PCR检测的重组质粒pEASY-T5-zero-TLR3；所述鸭为北京鸭(Anasplatyrhynchos)。2.一种用于鸭的TLR3基因的荧光定量PCR检测的引物，其特征在于，所述引物的序列如SEQIDNo.3、SEQIDNo.4所示；所述鸭为北京鸭(Anasplatyrhynchos)。3.一种鸭的TLR3基因的荧光定量PCR检测方法，其特征在于，所述检测方法包括如下步骤：步骤一、荧光定量PCR反应体系及条件的优化：以重组质粒pEASY-T5-zero-TLR3为模板，采用矩阵法筛选引物的最佳浓度，并对荧光定量PCR反应体系及反应条件进行优化；其中，所述引物的序列如SEQIDNo.3、SEQIDNo.4所示；步骤二、TLR3标准曲线的建立：以重组质粒pEASY-T5-duTLR3为标准品，测定其OD260值；根据所述标准品的分子量与质量浓度，计算其拷贝浓度，稀释，进行FQ-PCR扩增，以重组质粒pEASY-T5-duTLR3拷贝数的对数为X轴，循环次数为Y轴，建立标准曲线；步骤三、重复性验证：对1.0×103～108拷贝/μL的重组质粒pEASY-T5-duTLR3进行重复验证，每次重复设若干浓度梯度，每个浓度梯度设有若干平行处理；步骤四、敏感性验证：以重组质粒pEASY-T5-duTLR3为模板进行FQ-PCR检测；步骤五、特异性验证：通过样品与所述标准品的序列比对及样品的溶解曲线的峰型对检测方法的特异性进行双重验证；所述鸭为北京鸭(Anasplatyrhynchos)。4.根据权利要求3所述的鸭的TLR3基因的荧光定量PCR检测方法，其特征在于，步骤一中，所...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘光清，宋凯杰，陈宗艳，李传峰，孟春春，
申请(专利权)人：中国农业科学院上海兽医研究所，
类型：发明
国别省市：上海;31