一种萤火虫荧光素酶的编码基因及制备方法技术

本发明专利技术提供一种高效表达的高热稳定性荧光素酶编码基因及制备方法。该基因是通过对来源于Photinuspyralis的萤火虫荧光素酶基因进行分子改造后，通过化学合成获得。本发明专利技术提供的高效表达的高热稳定性荧光素酶编码基因目前未见报道，其在大肠杆菌中表达的荧光素酶占全细胞内可溶性蛋白质的72.1％～83.5％，荧光素酶的表达量为481～739mg/10g湿菌。本发明专利技术提供的高效表达的高热稳定性荧光素酶编码基因的表达产物是一种荧光素酶，该荧光素酶热稳定性高，在40℃下保温20min，仍能够保持95％左右的相对活性。

【技术实现步骤摘要】
一种萤火虫荧光素酶的编码基因及制备方法
本专利技术属于基因工程领域，具体涉及一种高效表达的高热稳定性萤火虫荧光素酶的编码基因，还涉及该萤火虫荧光素酶的制备方法。
技术介绍
萤火虫荧光素酶(EC1.13.12.5～7)属于氧化还原酶类，其中最典型的为北美萤火虫荧光素酶(EC1.13.12.7)。北美萤火虫荧光素酶由单一多肽链组成，含有511个氨基酸残基，相对分子量约为62KD，不含辅因子并且大部分氨基酸为非极性氨基酸。北美萤火虫荧光素酶的高级结构中含有两对二硫键和两个色氨酸，其发射光波长范围为552～582nm，最大吸收波长为562nm。萤火虫荧光素酶在腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)、O2以及Mg2+的参与下，能够催化D-荧光素氧化脱羧，并将化学能转化为光能，同时释放黄绿色荧光。具体反应过程及发光机制如下：萤火虫荧光素酶先将荧光素和Mg-ATP复合物转化为相应的过渡态产物虫荧光素腺苷酸；过渡态产物迅速与O2反应，释放出腺嘌呤核苷一磷酸(AMP)后，形成激发态产物氧化荧光素；激发态产物释放光量子回到基态。萤火虫荧光素酶在许多领域存在重要应用性。例如用于病原微生物的快速检测：当催化体系中的荧光素和其他成分过量时，催化发光的强度与ATP的量成正比，另一方面研究人员发现细菌中ATP的含量固定，因此可通过利用荧光素酶测定样品中的ATP含量来间接估测样品中细菌的数量。该方法被广泛应用于临床医学以及法医学检测、环境监测、生命科学研究等领域。此外，荧光素酶基因还能够作为报告基因用于检测目的基因的表达情况：利用荧光素酶基因与目的基因的平行表达，能够显示目的基因在什么时间、部位以及诱因下进行表达。荧光素酶的另一个重要应用是用于核酸序列的测序分析：荧光素酶、DNA聚合酶、ATP硫酸化酶和腺苷三磷酸双磷酸酶四种酶催化的同一反应体系中的酶级联反应构成了焦磷酸测序技术的核心。虽然萤火虫荧光素酶存在着重要的应用价值，但其热稳定性差一定程度限制了其应用。尤其是当应用于焦磷酸测序技术中，测序反应体系需要进行高温延伸步骤，对萤火虫荧光素酶的热稳定性有相对更高的要求。早期主要是利用亲和层析和分级沉淀技术从各种萤火虫的发光器官中提取萤火虫荧光素酶，该方法需要人工繁殖和捕捉萤火虫，受到季节和地域的限制，制备周期长、成本高。随着基因工程技术的发展，研发人员开始采用基因工程的方法，将萤火虫荧光素酶基因克隆到大肠杆菌中，用于表达重组萤火虫荧光素酶，经过体外检测，重组酶具有与野生型荧光素酶相当的催化特性与活性。一方面，有研究公开了以萤火虫荧光素酶植物表达报告载体pXP2为模板，扩增得到编码萤火虫荧光素酶的基因(luc)，构建了诱导型表达载体pQE30-luc；转化其宿主菌E.coliM15，获得高效诱导表达萤火虫荧光素酶基因的重组菌M15/pQE30-luc，表达量占全菌胞内可溶性蛋白的50.9％；并利用Ni柱纯化表达具有活性的萤火虫荧光素酶,纯化后比酶活达到1.43×109RFU/mg(夏蕾，饶志明，沈微，等.荧光素酶编码基因luc在大肠杆菌中的克隆、表达及纯化[J].食品与生物技术学报，2008,27(5):62-66)。另有研究公开通过PCR扩增技术获得萤火虫荧光素酶基因，然后利用DNA重组技术将荧光素酶基因连接到表达载体pET28a中。经过酶切和测序鉴定获得重组荧光素酶的高效表达载体。并利用离子交换层析和亲和层析对荧光素酶进行分离纯化，最终4g湿菌分离纯化出了50mL荧光素酶，利用Braford法测得其浓度为2.5mg/mL。即4g湿菌分离纯化出125mg荧光素酶(刘艳杰.重组萤火虫荧光素酶及其稳定性研究[D].天津大学,2010.)。另一方面，中国专利申请CN102191213A中公开了在北美萤火虫荧光素酶基因中通过overlapPCR引入突变，连接于表达载体，生产高热稳定性及高酶活特性的萤火虫荧光素酶突变酶，该突变酶的发光强度是野生型的15-20倍左右，并且较野生型具有良好的热稳定性。上述研究或是直接利用现有荧光素酶基因报告载体作为模板直接扩增荧光素酶基因，用于构建重组载体和重组工程菌，并通过对重组工程菌发酵条件的优化提高重组荧光素酶的产量，虽然构建的重组载体能够表达具有活性的重组荧光素酶，但其热稳定性相对于实际需求仍亟待提高。或是通过分子生物学技术对野生型萤火虫荧光素酶基因进行突变，以提高其热稳定性，虽然其热稳定性获得提高，但其蛋白产量仍无法满足实际需求。在实际应用中，商品化的荧光素酶价格仍比较昂贵并且多为从萤火虫中直接提取，例如，SIGMA-ALDRICH公司生产的萤火虫荧光素酶价格高达2371元/mg。因此，提供一种能够高效表达的，同时具备相对较高的热稳定性的荧光素酶是其商品化生产以及实际应用中需要解决的重要问题。
技术实现思路
术语本专利技术中出现的英文名称“hluc”代表本专利技术所述“一种高效表达的高热稳定性荧光素酶编码基因”；本专利技术中出现的英文名称“luc”代表本专利技术所述“来源于Photinuspyralis的萤火虫荧光素酶原始基因”；本专利技术中出现的英文名称“HLUC”代表本专利技术所述“一种高效表达的高热稳定性荧光素酶”；本专利技术中出现的英文名称“LUC”代表本专利技术所述“来源于Photinuspyralis的萤火虫荧光素酶原始基因所表达的荧光素酶”；本专利技术要解决的一个问题是提供一种高效表达的高热稳定性荧光素酶编码基因。所述高效表达的高热稳定性荧光素酶编码基因是以来源于Photinuspyralis的萤火虫荧光素酶基因为原始基因luc，通过分子改造获得。本专利技术采取的技术方案是：上述高效表达的高热稳定性荧光素酶编码基因的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示：ATGGAAGACGCTAAAAACATCAAAAAAGGTCCGGCTCCGTTCTACCCGCTGGAAGACGGTACTGCTGGTGAACAGCTGCACAAAGCTATGAAACGTTACGCTCTGGTTCCGGGTACTATCGCTTTCACCGACGCTCACATCGAAGTTAACATCACCTACGCTGAATACTTCGAAATGTCTGTTCGTCTGGCTGAAGCTATGAAACGTTACGGTCTGAACACCAACCACCGTATAGTTGTATGCAGCGAAAACTCTCTGCAATTCTTCATGCCGGTTCTGGGTGCTCTGTTCATCGGTGTTGCTGTTGCTCCGGCTAACGACATCTACAACGAACGTGAACTGCTGAACTCTATGAACATCTCTCAGCCGACCGTTGTTTTCGTTTCTAAAAAAGGTCTGCAAAAAATCCTGAACGTTCAGAAAAAACTGCCGATCATCCAGAAAATCATCATCATGGACTCTAAAACCGACTACCAGGGTTTCCAGTCTATGTACACCTTCGTTACCTCTCACCTGCCACCCGGCTTCAACGAATACGACTTCGTTCCAGAGAGCTTCGACCGTGACAAGACCATCGCTCTGATCATGAACTCTTCTGGTTCTACCGGTCTGCCGAAAGGTGTTGCTCTGCCGCACCGTACCGCTTGCGTTCGTT本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种高效表达的高热稳定性荧光素酶编码基因，其特征在于：所述高效表达的高热稳定性荧光素酶编码基因的序列为SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

【技术特征摘要】
1.一种高效表达的高热稳定性荧光素酶编码基因，其特征在于：所述高效表达的高热稳定性荧光素酶编码基因的序列为SEQIDNO：1所示的核苷酸序列。2.一种荧光素酶重组表达载体，其特征在于：所述荧光素酶重组表达载体携带如权利要求1所述高效表达的高热稳定性荧光素酶编码基因。3.一种荧光素酶重组基因工程菌，其特征在于：所述荧光素酶重组基因工程菌携带如权利要求1所述高效表达的高热稳定性荧光素酶编码基因。4.一种权利要求3所述的荧光素酶重组基因工程菌的构建方法，其特征在于所述构建方法包括以下步骤：⑴.采用化学全合成的方法合成高效表达的高热稳定性荧光素酶编码基因，同时在上、下游各引入一个酶切位点以及相应保护碱基；⑵.将步骤⑴获得的带有上下游酶切位点与保护碱基的高效表达的高热稳定性荧光素酶编码基因构建到大肠杆菌表达载体中，获得荧光素酶重组表达载体；⑶.用步骤⑵获得的重组表达载体转化大肠杆菌宿主菌，得到荧光素酶重组基因工程菌。5.如权利要求4所述构建方法，其特征在于：所述的上游或下游酶切位点是AatII、AvaI、KpnI、NdeI、NcoI、NotI、EcoRV、SalI、SbfI、SacI、SacII、BamHI、BglII、EcoRI、PstI、XhoI、XbaI和HindIII中的任意一个；上游与下游酶切位点应当不同，且应当同时位于所选用的表达载体的多克隆位点区。6.如权利要求4所述构建方法，其特征在于：所述的表达载体是pMAL-p5E、pMAL-p5X、pMAL-p4E、pMAL-p4X、pET-42a(+)、pE...

【专利技术属性】
技术研发人员：高静，蔡亦梅，吴超，徐潇，张睿，王者馥，王绪敏，殷金龙，任鲁风，
申请(专利权)人：北京中科紫鑫科技有限责任公司，
类型：发明
国别省市：北京;11