本发明专利技术公开了桂花花序不同发育时期荧光定量内参基因及应用，所述内参基因为OfACT和OfEF1α；其中，所述内参基因OfACT的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示，内参基因OfEF1α的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:2所示。本发明专利技术桂花花序不同发育时期荧光定量内参基因OfACT和OfEF1α基因是桂花不同发育时期花序中表达最稳定的两个内参基因，该两个基因表达的稳定性优于现有技术中的其他基因，作为荧光定量内参基因能为桂花不同发育时期花序中获得功能基因表达的精确定量数据提供有力支持。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分子生物学领域，特别是涉及桂花花序不同发育时期荧光定量内参基 因及应用。
技术介绍
桂花（Osmanthus fragrans Lour.)是我国十大传统名花之一，也是我国重要 的园林植物之一。根据花期桂花可分为秋桂和四季桂两大类，秋桂又可根据花色分为 金桂（Luteus group，黄色至金黄色系）、银桂（Albus group，黄白色至黄色系）和丹桂 (Aurantiacus group，橙色至橙红色系）品种群。导致秋桂不同品种群花色差异的分子机 制一直是科学家们感兴趣的领域。 对于桂花不同花色品种，类胡萝卜素的种类及其含量是决定其花色呈现的最主要 因素。参与调控类胡萝卜素代谢的相关基因的表达分析试验，是近年来研宄秋桂不同品种 群花色差异的分子机制的重要手段，因此研宄者常利用实时荧光定量PCR技术研宄不同花 色品种群桂花不同发育时期花序中胡萝卜素代谢的相关基因的表达水平。 荧光实时定量PCR(qRT-PCR)由于其敏感性高及特异性好被广泛应用于基因表达 研宄，而其结果的准确性在很大程度上取决于内参基因的稳定性。理想的内参基因应该在 不同的基因型、不同发育阶段、不同组织器官和不同胁迫条件下恒定表达，但事实上这样的 理想内参基因根本不会存在。因此，需要根据不同物种及不同试验条件筛选合适的内参基 因，这对获得准确的qRT-PCR实验结果是非常重要的。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是筛选出桂花不同发育时期花序中表达最稳定的内参 基因，能为桂花不同发育时期花序中获得功能基因表达的精确定量数据提供有力支持。 桂花花序不同发育时期荧光定量内参基因，所述内参基因为OfACT和OfEFla ;其 中，所述内参基因OfACT的核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0:1所示，内参基因OfEFla的 核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0:2所示。 本专利技术所述的桂花花序不同发育时期荧光定量内参基因，其中所述OfACT基因的 特异性引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO: 3和SEQ ID NO: 4所示，所述OfEFla基 因的特异性引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0:5和SEQ ID N0:6所示。 OfACT基因的特异性引物为： OfACT-F :5' -CCCAAGGCAAACAGAGAAAAAAT-3， OfACT-R ： 5r -ACCCCATCACCAGAATCAAGAA-3r ；OfEFla基因的特异性引物为： OfEFla -F :5，-CGTTTGCCACTTCAGGATGTCTA-3， 0fEFla-R:5' -GTACCAGGTTTCAGGACTCCAGTTT-3'。 本专利技术所述的内参基因OfACT和OfEFl a在相对定量法实时荧光定量PCR中的应 用，桂花不同发育时期花序中功能基因表达试验中采用内参基因定量，所述桂花OfACT和 OfEFl a基因在相对定量法实时荧光定量PCR中作为内参基因使用。 本专利技术内参基因的具体筛选步骤为：1?候选内参基因序列的获得：选取桂花Actin (OfACT)、Elongation factor-1 a (OfEFl a )、NADP-isocitrate dehydrogenase (OfIDH)、GTP-binding protein RANI(OfRANl)、Beta_tubulin(OfTUB)、Ubiquitin_conjugating enzyme E2(0fUBC2)和 18S ribosomal RNA(0fl8S)共7个内参基因作为内参基因的候选基因。 2.引物设计：根据获得的候选基因序列设计该基因相应的特异引物（扩增产物单 一，具体为溶解曲线峰单一，2 %的琼脂糖胶检测条带单一）。 3. PCR模板的准备：收集样品后，用RNA提取试剂盒（RNApr印pure Plant Kit，天 根）提取样品总RNA，然后用cDNA反转试剂盒（Reverse Transcriptase M_MLV，Takara)按 照说明书反转cDNA的第一链，作为荧光定量PCR的模板。 4.荧光定量PCR反应：以反转的cDNA为模版，用内参基因相应的特异引物在ABI 7300 real-time PCR仪中进行扩增。获得各个基因的表达数据Ct值。 5.根据所得Ct值通过GeNorm v3. 4软件计算候选内参基因的稳定性，筛选出表达 最稳定的内参基因并确定最优内参基因数目。 本专利技术桂花花序不同发育时期荧光定量内参基因与现有技术不同之处在于：本发 明桂花花序不同发育时期荧光定量内参基因OfACT和OfEFl a基因是桂花不同发育时期 花序中表达最稳定的两个内参基因，该两个基因表达的稳定性优于候选的另外五个内参基 因，作为荧光定量内参基因能为桂花不同发育时期花序中获得功能基因表达的精确定量数 据提供有力支持。 本专利技术桂花花序不同发育时期荧光定量内参基因的有益效果： 1.本专利技术首次从七种候选内参基因中筛选出桂花不同发育时期花序中表达最稳 定的内参基因，数据真实可靠。 2.筛选出的内参基因适用于桂花不同发育时期花序中类胡萝卜素代谢相关基因 或其他功能基因的表达分析，能显著提高所得数据的准确性。其应用较为普遍，操作相对简 单，成本较低，灵敏度高，精确度高。 3.本研宄筛选出的内参基因是经过严格的内参筛选程序选出的，是桂花不同发育 时期花芽中表达最稳定的内参基因。 下面结合附图对本专利技术的桂花花序不同发育时期荧光定量内参基因作进一步说 明。【附图说明】 图1为本专利技术中GeNorm软件计算出的各内参管家基因表达稳定值； 图2为本专利技术中GeNorm软件通过成对变异系数（Vn/Vn+1)确定最适合的内参基 因的数目。【具体实施方式】 实施例1 桂花不同发育时期花序中表达最稳定的内参基因的筛选，包括如下步骤： 1.实验材料取样：浙江农林大学平山苗圃十年生地栽桂花'堰虹桂'为实验材料， 分别于2014年8月9日、8月15日、8月22日、8月29日、9月4日、9月10日、9月17日、 9月23日、9月24日和9月25日对不同发育状态花序进行取样，其中9月17日花序状态 为圆珠期，9月23日花序状态为铃梗期，9月24日花序状态为半开期，9月25日花序状态为 盛开期。花芽样品离体后速冻于液氮中，然后至于_80°C保存。 2?花序材料总RNA提取：采用RNAprep pure Plant Kit (天根）按照说明书步骤 提取花序样品总RNA。 3. cDNA的第一链的合成： 米用 Reverse Transcriptase M-MLV (Takara)按照说明书将步骤 2 获得的总 RNA 反转成cDNA，作为荧光定量PCR模板。 (1)在0. 2ml的PCR管中配制下列模板RNA/引物混合液，全量6 y 1 :【主权项】1. 桂花花序不同发育时期荧光定量内参基因，其特征在于：所述内参基因为OfACT和 OfEFla;其中，所述内参基因OfACT的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO: 1所示，内参基因 OfEFla的核苷酸序列如序列表中SEQIDN0:2所示。2. 根据权利要求1所述的桂花花序不同发育时期荧光定量内参基因，其特征在于：所 述本文档来自技高网...
【技术保护点】
桂花花序不同发育时期荧光定量内参基因，其特征在于：所述内参基因为OfACT和OfEF1α；其中，所述内参基因OfACT的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示，内参基因OfEF1α的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:2所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：赵宏波，张超，付建新，王艺光，包志毅，
申请(专利权)人：浙江农林大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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