一种检测FFPE样本DNA含量及完整性的方法技术

本发明专利技术公开了一种检测FFPE样本DNA含量及完整性的方法。该方法包括以下步骤：S1，根据FFPE样本的内参基因设计产物长度为Mbp和Nbp的两对引物，其中，M<N；S2，取不同降解程度的样本，使用qPCR方法进行定量，并使用人全基因组DNA标准品采用扩增Mbp产物的扩增引物进行标准曲线的绘制；S3，每个样本分别采用上述两对引物进行扩增，根据Mbp产物的浓度确定DNA的有效浓度，根据Mbp产物与Nbp产物的CT差值判断DNA的降解程度；以及S4，根据样本的检测结果及建库信息分析结果确定量化的判定标准。应用本发明专利技术的技术方案，能够精准测定FFPE DNA的有效浓度，并且量化其降解程度。

【技术实现步骤摘要】
一种检测FFPE样本DNA含量及完整性的方法
本专利技术涉及生物
，具体而言，涉及一种检测FFPE样本DNA含量及完整性的方法。
技术介绍
FFPE为福尔马林固定、石蜡包埋的样本。这类病理样本是珍贵且来源广泛的生物医学研究材料。而二代测序的不断发展及其在医学上的应用给临床复杂疾病的基因诊断和治疗带来了新的曙光。FFPE样本测序流程主要分为核酸提取、文库构建、上机测序及数据分析、解读四个部分。而提取的核酸的质量对建库的成功与否乃至下机数据的可靠性都起着重要的作用，因此对提取后核酸进行严格的质控就显得尤为重要。而目前传统的核酸检测方法由于易受到杂质，高级结构等影响从而无法准确的评估FFPE样本的DNA有效浓度及完整性。目前检测DNA浓度的方法主要为分光光度计法和Qubit荧光剂法。分光光度计是利用核酸分子结构中的嘌呤、嘧啶碱基具有共轭双健系统(－C＝C一C＝C一)，能够强烈吸收250-280nm波长的紫外光；核酸(DNA/RNA)的最大紫外吸收值在260nm处；遵照Lambert-Beer定律，可以从紫外光吸收值的变化来测定核酸物质的含量。尽管紫外吸收定量法是最常用的一种DNA定量方法，但其读数并不可靠且不准确。紫外吸光度法能够检测吸光度为260nm的所有物质，包括DNA、RNA、蛋白质、降解核酸和游离核苷酸。因此其无法准确对FFPE样本的有效DNA片段进行定量。另一种常用的DNA定量仪器2.0/3.0荧光计采用专门研制的荧光检测技术，该技术采用只有与DNA结合后才发出荧光的分子染料；这些荧光染料只有与特异性的靶分子结合时，才能发出荧光信号，从而测定DNA浓度。但是其测定的浓度包含所有的DNA片段，包括降解的(如小于100bp)DNA片段。而这部分小片段对于DNA样本的后期建库是无意义的。Qubit荧光计定量受样本杂质的影响也较大。这两种方法检测的DNA浓度受DNA溶液中蛋白质等杂质的影响较大，因此定量不准确。目前检测DNA完整性/降解程度使用较多的方法为琼脂糖凝胶电泳及安捷伦2100生物分析仪(AligentBioanlyzer2100)。琼脂糖凝胶电泳是利用DNA片段迁移距离与碱基对的对数成反比，通过已知大小的标准物移动的距离与未知片段的移动距离进行比较，得出未知片段的大小，进而对FFPE样本DNA的降解程度进行检测。但是该检测方法受杂质如蛋白质与DNA交联的影响较大，迁移率受到影响，从而无法准确判断其降解程度。而且该方法也不能对FFPEDNA样本的降解程度进行量化。AligentBioanlyzer2100也存在着同样的问题，同时其仪器成本及检测成本也比较高。为了精确检测FFPE样本DNA的含量及完整性，并且将其成本降至最低，从而为建库提供准确的指导，避免样本、时间、试剂、人力等成本的浪费，亟待开发新的检测FFPE样本DNA的含量及完整性方法和产品。
技术实现思路
本专利技术旨在提供一种检测FFPE样本DNA含量及完整性的方法，以精确检测FFPE样本DNA的含量及完整性。为了实现上述目的，根据本专利技术的一个方面，提供了一种检测FFPE样本DNA含量及完整性的方法。该方法包括以下步骤：S1，根据FFPE样本的内参基因设计产物长度为Mbp和Nbp的两对引物，其中，M<N；S2，取不同降解程度的样本，使用qPCR方法进行定量，并使用人全基因组DNA标准品采用扩增Mbp产物的扩增引物进行标准曲线的绘制；S3，每个样本分别采用上述两对引物进行扩增，根据Mbp产物的浓度确定DNA的有效浓度，根据Mbp产物与Nbp产物的CT差值判断DNA的降解程度；以及S4，根据样本的检测结果及建库信息分析结果确定量化的判定标准。进一步地，M为50～100bp；N为150～300bp。进一步地，S2中取n个不同降解程度的样本，其中，n不少于200。进一步地，内参基因为GAPDH基因。进一步地，M＝74，N＝195，n＝200。进一步地，Mbp产物的扩增引物为SEQIDNO：1和SEQIDNO：2；Nbp产物的扩增引物为SEQIDNO：3和SEQIDNO：4。进一步地，S4确定量化的判定标准为：应用本专利技术的技术方案，主要针对FFPE的DNA样本，采用qPCR方法对其进行准确的质控，使用内参基因，设计长度不同的两对引物，在本专利技术中只需绘制较短产物的标准曲线，通过标准曲线计算FFPEDNA的有效浓度，通过两个产物的CT差值判定DNA的降解程度，DNA降解越严重，其CT差值越大。本专利技术能够精准测定FFPEDNA的有效浓度，并且量化其降解程度；从而为后续的建库、上机、信息分析提供准确的指导。附图说明构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本专利技术的进一步理解，本专利技术的示意性实施例及其说明用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的不当限定。在附图中：图1示出了实施例1中检测FFPE样本DNA含量及完整性的流程示意图；以及图2示出了实施例1中FFPEDNA样本A、B的琼脂糖凝胶电泳图。具体实施方式需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本专利技术。根据本专利技术一种典型的实施方式，提供一种检测FFPE样本DNA含量及完整性的方法。该方法包括以下步骤：S1，根据FFPE样本的内参基因设计产物长度为Mbp和Nbp的两对引物，其中，M<N；S2，取不同降解程度的样本，使用qPCR方法进行定量，并使用人全基因组DNA标准品采用扩增Mbp产物的扩增引物进行标准曲线的绘制；S3，每个样本分别采用上述两对引物进行扩增，根据Mbp产物的浓度确定DNA的有效浓度，根据Mbp产物与Nbp产物的CT差值判断DNA的降解程度；以及S4，根据样本的检测结果及建库信息分析结果确定量化的判定标准。应用本专利技术的技术方案，主要针对FFPE的DNA样本，采用qPCR方法对其进行准确的质控，使用内参基因，设计长度不同的两对引物，在本专利技术中只需绘制较短产物的标准曲线，通过标准曲线计算FFPEDNA的有效浓度，通过两个产物的CT差值判定DNA的降解程度，DNA降解越严重，其CT差值越大。本专利技术能够精准测定FFPEDNA的有效浓度，并且量化其降解程度；从而为后续的建库、上机、信息分析提供准确的指导。较短的Mbp长度的产物可以很好的反应FFPEDNA内部产物的实际浓度。若DNA完整性越差，降解越严重，Nbp长产物与Mbp短产物的CT差值越大，因此通过CT差值的大小可以精确的反应DNA的降解程度。M的长度应该在50-100bp之间；N的长度应该在150-300bp之间。CT差值要能明确区分不同降解程度的DNA样本。优选的，S2中取n个不同降解程度的样本，其中，选定样本的数量n应不少于200个，选择大量样本可以通过统计学方法获得DNA样本降解程度判定标准的准确数据。根据本专利技术一种典型的实施方式，内参基因为GAPDH基因。GAPDH为甘油醛-3-磷酸脱氢酶的编码基因。该酶是糖酵解反应中的一个酶，该酶基因为管家基因，几乎在所有组织中都高水平表达，并且表达量是恒定的。因此使用GAPDH基因进行FFPEDNA样本的有效浓度及完整性的检测。根据本专利技术一种典型的实施方式，M＝74，N＝195，n＝200。优选的，Mbp产物的扩增引本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测FFPE样本DNA含量及完整性的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1，根据FFPE样本的内参基因设计产物长度为Mbp和Nbp的两对引物，其中，M<N；S2，取不同降解程度的样本，使用qPCR方法进行定量，并使用人全基因组DNA标准品采用扩增Mbp产物的扩增引物进行标准曲线的绘制；S3，每个所述样本分别采用上述两对引物进行扩增，根据Mbp产物的浓度确定DNA的有效浓度，根据Mbp产物与Nbp产物的CT差值判断DNA的降解程度；以及S4，根据所述样本的检测结果及建库信息分析结果确定量化的判定标准。

【技术特征摘要】
1.一种检测FFPE样本DNA含量及完整性的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1，根据FFPE样本的内参基因设计产物长度为Mbp和Nbp的两对引物，其中，M<N；S2，取不同降解程度的样本，使用qPCR方法进行定量，并使用人全基因组DNA标准品采用扩增Mbp产物的扩增引物进行标准曲线的绘制；S3，每个所述样本分别采用上述两对引物进行扩增，根据Mbp产物的浓度确定DNA的有效浓度，根据Mbp产物与Nbp产物的CT差值判断DNA的降解程度；以及S4，根据所述样本的检测结果及建库信息分析结果确定量化的判定标准。2.根据权利要求1所述的方法，其特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：李宗梅，夏赟，蒋智，师文霞，
申请(专利权)人：天津诺禾医学检验所有限公司，
类型：发明
国别省市：天津,12