构建RRBS文库的Y型接头、试剂盒及方法技术

本发明专利技术提供了一种构建RRBS文库的Y型接头、试剂盒及方法。该Y型接头包括：甲基化接头1：5'‑acactctttccctacacgacgctcttccgatctn1‑3'；甲基化接头2：5'‑n2n1’agatcggaagagcacacgtctgaactccagtcac‑3'；其中，甲基化接头1和甲基化接头2退火形成Y型接头，甲基化接头1和甲基化接头2中的碱基c均为甲基化修饰的c，n1和n1’为互补配对的保护碱基序列，n1或n1’的碱基数目为6～12个，n2为酶切位点粘性末端碱基，n2的碱基数目为1～5个。该接头有助于提高测序数据产出，同时提高酶切效率的评估及其准确性。

【技术实现步骤摘要】
构建RRBS文库的Y型接头、试剂盒及方法
本专利技术涉及分子育种领域，具体而言，涉及一种构建RRBS文库的Y型接头、试剂盒及方法。
技术介绍
RRBS(Reducedrepresentationbisulfitesequencing)，即简并代表性亚硫酸氢盐测序技术，是一种用于基因组单核苷酸级别的甲基化水平分析的高效的高通量测序技术。其原理即利用限制性内切酶MspI与片段选择相结合的方式富集基因组中高GC区域，再通过亚硫酸氢盐测序方法，得到基因组单核苷酸级别的甲基化水平分析结果。目前的建库方案由以下几个步骤组成：酶切---纯化---末端修复加A尾---连接接头---CT转化---回收目的片段。然而，现有的方法所构建的文库获得测序数据后，通过生物信息学对酶切效率进行评估时，往往出现评估结果偏低的状况。对于此种状况，现有技术中尚无有效的解决方案。
技术实现思路
本专利技术的主要目的在于提供一种构建RRBS文库的Y型接头、试剂盒及方法，以解决现有技术中酶切效率评估结果偏低的缺陷。为了实现上述目的，根据本专利技术的一个方面，提供了一种用于甲基化文库构建的Y型接头，该Y型接头包括：甲基化接头1：5'-acactctttccctacacgacgctcttccgatctn1-3'；甲基化接头2：5'-n2n1’agatcggaagagcacacgtctgaactccagtcac-3'；其中，甲基化接头1和甲基化接头2退火形成Y型接头，甲基化接头1和甲基化接头2中的碱基c均为甲基化修饰的c，n1和n1’为互补配对的保护碱基序列，n1或n1’的碱基数目为6～12个，n2为酶切位点粘性末端碱基，n2的碱基数目为1～5个。进一步地，保护碱基序列为6～8个随机碱基形成的序列。进一步地，n2的碱基数目为2～4个。进一步地，酶切位点粘性末端碱基为MspI、BglII、XmaI或TaqI酶切产生的末端碱基。进一步地，甲基化接头1为：5'-acactctttccctacacgacgctcttccgatctatgcag-3'；甲基化接头2为：5'-cgctgcatagatcggaagagcacacgtctgaactccagtcac-3',其中，甲基化接头1和甲基化接头2中的碱基c均为甲基化修饰的c。为了实现上述目的，根据本专利技术的第二个方面，提供了一种构建RRBS文库的方法，该方法包括：采用内切酶及上述任一种Y型接头，对待测基因组DNA进行边酶切边连接接头，得到带接头片段；对带接头片段进行片段长度选择，得到目标长度片段；对目标长度片段进行CT转化，得到转化片段；对转化片段进行PCR扩增，得到RRBS文库。进一步地，采用电泳切胶回收的方法对带接头片段进行片段长度选择，得到目标长度片段。进一步地，对转化片段进行PCR扩增后，还包括对PCR扩增产物进行纯化，从而得到RRBS文库。根据本专利技术的第三个方面，提供了一种构建RRBS文库的试剂盒，该试剂盒包括Y型接头，Y型接头为上述任一种Y型接头。进一步地，试剂盒还包括核酸内切酶，该核酸内酶产生的粘性末端的碱基与前述Y型接头中n2所示的酶切位点粘性末端碱基相同。应用本专利技术的技术方案，一方面通过增加与测序引物的第一个碱基互补配对的碱基T，使得测序引物测得的第一个碱基为N的概率降低，提高测序数据产出，有助于提高酶切效率的评估及其准确性。另一方面通过增加保护碱基，使得酶切位点相关的碱基的测序质量相对较高，进而提高酶切效率评估结果及其准确性。此外，将Y型接头的3’末端改为酶切位点的粘性末端碱基，从而既减少了现有此类文库构建方法中需要在酶切后先进行纯化，再进行末端修复加A尾，再连接头的繁琐步骤(实验步骤减少3个、时间上相较于原来缩短3h)，又避免了末端修复过程中的错配，进而使得接头连接后保持酶切位点序列碱基的准确性，进而提高酶切效率评估结果的准确性。具体实施方式需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本专利技术。如
技术介绍
所提到的，现有的RRBS文库构建的方法通过限制性内切酶，在酶切后通过末端修复加A尾，然后再利用A与接头末端T碱基互补配对的方法加上接头。专利技术人经分析发现，这种建库方法在末端修复加A的过程中会出现错配，而文库测序产生的测序数据在进行生物信息分析时，会根据酶切位点的碱基序列来评估酶切效率，因而这种末端修复产生的错配会降低酶切效率的评估结果。针对上述原因，专利技术人对现有的Y型接头的结构进行了改进，具体思路如下：现有的小Y型接头+T(测序引物最后一个碱基与之互补配对，若去掉容易导致产出降低、测序第一个碱基位点含N，会大大降低酶切效率的评估)+碱基保护序列(通常测序前6个碱基的测序质量低，影响链接效率的评估和比对(mapping)计算，因此可以加上6个碱基的保护序列，但具体数目可以适当调整)+酶切位点粘性末端碱基(可以是3个，也可以根据不同的酶切位点比如，BglII、XmaI、TaqI做出调整)。并经过实验验证，改进后的Y型接头能够大大提高酶切效率的评估结果，从而使得评估结果更接近真实情况。基于上述研究结果，申请人提出了本申请的改进方案。在本申请一种典型的实施方式中，提供了一种用于甲基化文库构建的Y型接头，Y型接头包括：甲基化接头1：5'-acactctttccctacacgacgctcttccgatctn1-3'(SEQIDNO:1)；甲基化接头2：5'-n2n1’agatcggaagagcacacgtctgaactccagtcac-3'(SEQIDNO:2)；其中，甲基化接头1和甲基化接头2退火形成Y型接头，甲基化接头1和甲基化接头2中的碱基c均为甲基化修饰的c，n1和n1’均为互补配对的保护碱基序列，n1或n1’的碱基数目为6～12个，n2为酶切位点粘性末端碱基，n2的碱基数目为1～5个。上述甲基化接头1中的前32位碱基和甲基化接头2中的后33位碱基，为现有的Y型接头序列中的一部分。甲基化接头1中的第33位碱基t和甲基化接头2中从3'端数第34位碱基a，是为了便于使测序引物的最后一个碱基与接头互补配对，该碱基的存在有助于提高数据产出，降低测序第一个碱基为N的概率，从而提高酶切效率评估结果的准确性。通过增加保护碱基，使得酶切位点相关的碱基的测序质量相对较高，进而提高酶切效率评估结果及其准确性。此外，将Y型接头的3’末端改为酶切位点的粘性末端碱基，从而既减少了现有此类文库构建方法中需要在酶切后先进行纯化，再进行末端修复加A尾，再连接头的繁琐步骤(实验步骤减少3个、时间上相较于原来缩短3h)，又避免了末端修复过程中的错配，进而使得接头连接后保持酶切位点序列碱基的准确性，进而提高酶切效率评估结果的准确性。上述Y型接头中，保护碱基序列的具体长度虽然优选是6个碱基以上的，比如，优选为6～8个随机碱基形成的随机序列。但本申请也不排除在某些特殊情况下，也可以是少于6个本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种构建RRBS化文库的Y型接头，其特征在于，所述Y型接头包括：/n甲基化接头1：5'-acactctttccctacacgacgctcttccgatctn1-3'；/n甲基化接头2：5'-n2n1’agatcggaagagcacacgtctgaactccagtcac-3'；/n其中，所述甲基化接头1和所述甲基化接头2退火形成所述Y型接头，所述甲基化接头1和所述甲基化接头2中的碱基c均为甲基化修饰的c，n1和n1’为互补配对的保护碱基序列，n1或n1’的碱基数目为6～12个，n2为酶切位点粘性末端碱基，n2的碱基数目为1～5个。/n

【技术特征摘要】
1.一种构建RRBS化文库的Y型接头，其特征在于，所述Y型接头包括：
甲基化接头1：5'-acactctttccctacacgacgctcttccgatctn1-3'；
甲基化接头2：5'-n2n1’agatcggaagagcacacgtctgaactccagtcac-3'；
其中，所述甲基化接头1和所述甲基化接头2退火形成所述Y型接头，所述甲基化接头1和所述甲基化接头2中的碱基c均为甲基化修饰的c，n1和n1’为互补配对的保护碱基序列，n1或n1’的碱基数目为6～12个，n2为酶切位点粘性末端碱基，n2的碱基数目为1～5个。


2.根据权利要求1所述的Y型接头，其特征在于，所述保护碱基序列为6～8个随机碱基形成的序列。


3.根据权利要求1所述的Y型接头，其特征在于，所述n2的碱基数目为2～4个。


4.根据权利要求1所述的Y型接头，其特征在于，所述酶切位点粘性末端碱基为MspI、BglII、XmaI或TaqI酶切产生的末端碱基。


5.根据权利要求1所述的Y型接头，其特征在于，
所述甲基化接头1为：5'-acactctttccctacacgacgctcttccgatctatgcag-3'；
所述甲基化接头2为：5'-cgctgc...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭松，孔维茜，李彪，骞蕾阳，吴国营，沈世超，
申请(专利权)人：天津诺禾医学检验所有限公司，
类型：发明
国别省市：天津;12