基于二硫键精准配对构建噬菌体展示多元环肽库的方法技术

基于二硫键精准配对构建噬菌体展示多元环肽库的方法，涉及环肽类化合物。实现精准调控三元环肽分子内的二硫键配对方式，将三元环肽模板融合表达于噬菌体表面，构建噬菌体三元环肽文库。利用CPPC基序具有优先生成平行配对的二聚体的倾向性质，将两个CPPC基序和两个半胱氨酸插入多肽骨架中，实现有效调控二硫键的配对和多肽折叠，通过改变两个CPPC基序和两个半胱氨酸的排布位置，使具有不同多环拓扑结构的新型富二硫键环肽化合物得以从头设计。无需借助天然环肽骨架和非天然氨基酸的插入，可以作为多环肽库的模板，并利用该模板成功构建了噬菌体三元环肽文库，筛选出并不是来源于天然产物支架结构的具有新结构的功能性环肽配体。

【技术实现步骤摘要】
基于二硫键精准配对构建噬菌体展示多元环肽库的方法
本专利技术涉及环肽类化合物，尤其是涉及一种基于二硫键精准配对构建噬菌体展示多元环肽库的方法。
技术介绍
环肽类化合物是一类结构特殊、构象稳定、生物活性广泛、作用机理独特的环状化合物，对靶标受体具有高的结合亲和力和特异性、细胞毒性低、口服利用度高。因此，针对环肽类化合物进行配体药物的研发引起了人们越来越多的关注。比如用于细菌及真菌性感染的环肽药物Telavancin和Dalbavancin；抗肿瘤环肽药物Lanreotide和Romidepsin，这些药物都已经成功上市并发挥了重大的医用价值。但是这些药物中尤其是一些富含二硫键的环肽药物，主要是提取于自然界的动植物。比如环肽药物Linaclotide，由14个氨基酸组成，分子内含有三对二硫键构成三元环肽，衍生自多种可致腹泻的大肠杆菌菌株所产生的热稳定性肠毒素，用于治疗成人的便秘性肠易激综合征(IBS-C)和慢性特发性便秘(CIC)。这些环肽经过数百万年的进化，不仅具有高度的结构刚性，而且具有结合包括细胞受体、离子通道蛋白等大量靶标的能力。但是这些进化后的环肽保留了很多保守氨基酸用于调控二硫键配对来稳定三级结构，因此在天然环肽基础上进行改造的工作很大程度上仅仅局限于那些保守度较低的残基部位，否则就会损害二硫键的配对和环肽结构。要想实现在不依赖于这些天然骨架的情况下，从头设计耐受序列修改的富二硫键环肽骨架，对我们来说都是一个巨大的挑战。为了解决富二硫键环肽折叠过程中的复杂性和二硫键异构重排的问题，也已经发展出一些用于调控二硫键精准配对的工作，比如利用半胱氨酸类似物(Muttenthaler,M.etal.Solvingthealpha-ConotoxinFoldingProblem:EfficientSelenium-DirectedOn-ResinGenerationofMorePotentandStableNicotinicAcetylcholineReceptorAntagonists.J.Am.Chem.Soc.132,3514-3522(2010)；Zheng,Y.W.,Zhai,L.X.,Zhao,Y.B.&Wu,C.L.OrthogonalCysteine-PenicillamineDisulfidePairingforDirectingtheOxidativeFoldingofPeptides.J.Am.Chem.Soc.137,15094-15097(2015).)(硒代半胱氨酸或者青霉胺)替代多肽链中的半胱氨酸残基。虽然这些半胱氨酸类似物确实是有效调控了二硫键的配对方式，但是这些类似物都属于非天然氨基酸，所以若将这些非天然氨基酸应用于生物体内表达多肽，工作量和难度都是很大的，因此发展出一种不依赖于非天然氨基酸而有效指导多肽的氧化折叠的方法是很有必要的。2012年，C.L.Wu等(Wu,C.L.,Leroux,J.C.&Gauthier,M.A.TwinDisulfidesforOrthogonalDisulfidePairingandtheDirectedFoldingofMulticyclicPeptides.Nat.Chem.4,1045-1050(2012))发现CXC基序和半胱氨酸间具有正交性配对的性质，因此设计合成了一系列含有CXC基序的多肽分子骨架，氧化折叠后获得了特定配对方式的多元环肽。但是目标产物的产率还是相对来说较低，仍然会有许多其他二硫键配对构型的产物。因此如何在不借助天然环肽骨架和非天然氨基酸的插入的前提下，发展出一种从头设计的耐受序列修改的多元环肽模板的新技术，从而实现三元环肽分子内更高精准程度的二硫键配对，用于噬菌体三元环肽文库的构建，从而有望筛选出具有新结构的功能性环肽配体和治疗性药物。自20世纪80年代噬菌体展示技术问世以来，该技术已成为针对众多靶标去发现多肽配体的最流行和最有力的策略。利用多肽而非小分子或蛋白质可以成功地靶向具有挑战性的药物靶标，包括蛋白质-蛋白质相互作用表面，从而成功填补小分子与大蛋白药物之间的缺口。而且与线性多肽相比，具有分子内二硫键的环肽自身构象受限，从而提高了靶标结合亲和力和对蛋白水解酶的抗性。为了扩大噬菌体展示肽库的多样性和提高多肽配体的性能，大量噬菌体环肽文库被展示出来并成功应用于多种靶标的筛选。1992年，O’Neil(O’Neil,K.T.,Hoess,R.H.,Jackson,S.A.,Ramachandran,N.S.,Mousa,S.A.,&DeGrado,W.F.IdentificationofnovelpeptideantagonistsforGPIIb/IIIafromaconformationallyconstrainedphagepeptidelibrary.Proteins:Struct.,Funct.,Genet.14，509-515(1992))构建了第一个噬菌体环肽展示文库(CX6C形式；C＝半胱氨酸；X＝任何随机氨基酸)，该文库由六个随机氨基酸和两侧的半胱氨酸组成，两个半胱氨酸氧化后生成环肽，最后针对血小板糖蛋白IIb/IIIa筛选出了高亲和力的环肽分子。由于该环肽的筛选性能良好和应用广泛，后续催生了商用的CX7C形式的噬菌体环肽文库(Noren,K.A.；Noren,C.J.ConstructionofHigh-ComplexityCombinatorialPhageDisplayPeptideLibraries.Methods23,169-178(2001))。与分子量相当的单环肽相比，双环肽的构象受到更多的限制，降低的构象自由度可限制与靶标结合的熵损失，从而以更高的亲和力结合靶标，并且对蛋白酶水解有更高的抵抗力，因此人们又将注意力转移到噬菌体多元环肽的构建。2009年，Heinis等(Heinis,C.；Rutherford,T.；Freund,S.；Winter,G.Phage-EncodedCombinatorialChemicalLibrariesBasedonBicyclicPeptides.Nat.Chem.Biol.5,502-507(2009))开发了一种通过化学翻译后修饰来构建噬菌体双环肽文库的方法。该文库(CX6CX6C形式)外源多肽包含三个半胱氨酸，与化合物三-(溴甲基)苯进行化学环化。后续针对包括蛋白酶血浆激肽释放酶和尿激酶型纤溶酶原激活剂(uPA)在内的一系列靶标进行了噬菌体筛选，可产生具有nM或pM级别亲和力的环肽配体，并表现出出色的靶标选择性。2013年，S.Y.Chen等(Chen,S.Y.；RenteroRebollo,I.；Buth,S.A.；Morales-Sanfrutos,J.；Touati,J.；Leiman,P.G.；Heinis,C.BicyclicPeptideLigandsPulledoutofCysteine-RichPeptideLibraries.J.Am.Chem.Soc.135,6562-6569(2013))在不使用烷基化试剂进行环化的CX6本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.基于二硫键精准配对构建噬菌体展示多元环肽库的方法，其特征在于包括以下步骤：/n1)选取两种具有富含二硫键环肽分子骨架的模板，在碱性条件下于水相中发生氧化反应生成两种氧化产物，合成多肽；/n2)选取步骤1)合成的多肽骨架b为模板，将该多肽模板融合表达于噬菌体表面，构建噬菌体多元环肽库。/n

【技术特征摘要】
1.基于二硫键精准配对构建噬菌体展示多元环肽库的方法，其特征在于包括以下步骤：
1)选取两种具有富含二硫键环肽分子骨架的模板，在碱性条件下于水相中发生氧化反应生成两种氧化产物，合成多肽；
2)选取步骤1)合成的多肽骨架b为模板，将该多肽模板融合表达于噬菌体表面，构建噬菌体多元环肽库。


2.如权利要求1所述基于二硫键精准配对构建噬菌体展示多元环肽库的方法，其特征在于在步骤1)中，所述模板为：
模板a：Y—aan—Y
其中，两个Y代表CPPC，aa代表任意一个氨基酸，n代表氨基酸的数目；
模板b：Y—aan—Y—aam—Y—aar—Y
其中，四个Y中有两个是CPPC，另两个Y是C，aa代表任意一个氨基酸，n、m、r代表氨基酸的数目。


3.如权利要求1所述基于二硫键精准配对构建噬菌体展示多元环肽库的方法，其特征在于在步骤1)中，所述合成的多肽包括但不限于：
H-WGCPPCGGKGGCPPCGW-NH2(peptide1)
H-WGCPPCSGGKGGSKGGSKGGSKGGCPPCGW-NH2(peptide2)
H-WGCPPCGGKGGCPPCGGKGGCGGKGGCGW-NH2(peptide3)
H-WGCGGKGGCPPCGGKGGCPPCGGKGGCGW-NH2(peptide4)
H-WGCPPCGGKGGCGGKGGCGWKGGCPPCGW-NH2(peptide5)
H-WGCPPCGGKGGCGGKGGCPPCGWKGGCGW-NH2(peptide6)。


4.如权利要求2所述基于二硫键精准配对构建噬菌体展示多元环肽库的方法，其特征在于所述氨基酸为L-型氨基酸；
所述多肽中的CPPC和C的位置可以随意改变，多肽模板中的随意氨基酸的个数也可以根据需要减少或增加，改变后二硫键精准配对仍然适用。


5.如权利要求1所述基于二硫键精准配对构建噬菌体展示多元环肽库的方法，其特征在于在步骤2)中，所述融合表达于噬菌体表面的多肽序列为：
CPPCXXXXXCXXXXXCXXXXXCPPC，由N端到C端，X表...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴川六，路帅敏，吴亚培，
申请(专利权)人：厦门大学，
类型：发明
国别省市：福建;35