白背飞虱不同龄期稳定表达的内参基因、其筛选方法及应用技术

本发明专利技术涉及“白背飞虱不同龄期稳定表达的内参基因、其筛选方法及应用”，属于生物技术领域。内参基因A1TU，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。本发明专利技术根据NCBI已经公开发表的其它昆虫相关基因序列，设计简并引物，PCR获得白背飞虱6个常用内参基因部分核苷酸序列，经过克隆、测序以及与NCBI数据库Blast比对，确定为白背飞虱内参基因的部分序列；随后又基于此序列设计特异性的定量引物，建立基于SYBR Green I染料技术的RT-qPCR方法，利用荧光定量PCR技术筛选出了白背飞虱不同龄期最稳定的内参基因A1TU，从而为今后研究不同龄期基因表达水平以及白背飞虱的基因功能方面建立坚实的基础。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于分子生物学中昆虫体内稳定表达的内参基因
，具体地涉及白 背飞虱不同龄期稳定表达的内参基因及其筛选方法及应用。
技术介绍
白背飞虱 White-backed planthopper (Sogatella furcifera (Horvdith))，属节肢 动物门，昆虫纲，半翅目，飞虱科，一生经历3个发育阶段，包括卵期、若虫期和成虫期，成虫 具有迀飞习性。水稻是白背飞虱适宜寄主，白背飞虱不仅可以刺吸水稻韧皮部汁液，还可以 传播多种病毒病，给水稻生产造成重大损失。白背飞虱在我国分布广泛，包括华南、华中、华 北、东北以及西南稻区，西北稻区可达新疆自治区的米泉等地都有其分布。 白背飞虱完成一个生命周期需要经过卵、若虫、成虫三种虫态，属于渐变态昆虫。 白背飞虱一年发生3~4代，雄成虫较雌成虫羽化早，雌成虫一生只交配1次，雄成虫可交 配3~4次，雌虫产卵的部位集中于稻株基部。白背飞虱存在着形态和行为的多态现象，即 迀飞型（以长翅型为代表）和居留型（以短翅型为代表），温度对白背飞虱翅型的分化起着 重要的作用，但一般情况下白背飞虱短翅型雄虫极少见。 近年来，实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术以其快速、灵敏、准确、重复性高、可定 量、适用范围广等特点优势，已被广泛应用于基因表达分析。在使用相对定量方法时需要一 个在实验组和对照组中表达量恒定的参考基因作为检测目的基因在特定条件下表达水平 变化的参照物，用来归一化二者的实验数据，这里的参考基因即为内参基因。一个内参基因 在特定的实验条件下能持续稳定的表达是其可应用的基本前提。理想的内参基因应该满足 以下条件：不存在假基因，以避免基因组DNA的扩增；高度或中度表达；稳定表达于不同类 型的细胞和组织；表达水平与目标基因相似；不受任何内源性或外源性因素的影响。常用 的内参基因都是维持正常的细胞生命活动所必须的基因，如Actin、18S、GAPDH、Tublin等， 但是没有一种内参基因 mRNA表达水平在所有的条件下是一成不变的，一些内参基因在某 种特定条件下，其表达可能发生变化。因此，研宄不同的环境条件下，某一有机体内基因的 表达情况，内参基因的选择至关重要。
技术实现思路
本专利技术提供的白背飞虱不同龄期稳定表达的内参基因，为白背飞虱不同龄期内参 基因的选择提供依据。 同时本专利技术还提供其筛选方法及应用。 本专利技术根据NCBI已经公开发表的其它昆虫相关基因序列，设计简并引物，PCR获 得白背飞虱6个常用内参基因部分核苷酸序列，经过克隆、测序以及与NCBI数据库Blast 比对，确定为白背飞虱内参基因的部分序列；随后又基于此序列设计特异性的定量引物，建 立基于SYBR Green I染料技术的RT-qPCR方法，利用荧光定量PCR技术筛选出了白背飞虱 不同龄期最稳定的内参基因，从而为今后研宄不同龄期基因表达水平以及白背飞虱的基因 功能方面建立坚实的基础。 白背飞虱不同龄期稳定表达的内参基因 A1TU，其核苷酸序列为SEQ ID NO :2。 白背飞虱不同龄期稳定表达的内参基因 AlTU的筛选方法，包括如下步骤： (1)白背飞虱饲养：白背飞虱为实验室饲养种群，饲养于人工气候箱中，饲养条件 是27±1°C，75±5%，光周期为16h光照：8h黑暗； (2)获得内参基因序列：GenBank数据库公开的白背飞虱18S序列，登录号为 JX556779. I ;RPL9和RPLlO的序列由转录组测序获得，其获得具体过程为利用Ion Proton II测序平台，对白背飞虱唾液腺组织总RNA进行高通量测序，根据注释结果查找获得RPL9 和RPLlO的序列，与数据库中的序列Blast比对，确定了 RPL9和RPLlO的部分序列，见SEQ ID NO :7和SEQ ID NO :8 ;基于NCBI已经公开的相关基因序列，设计合成了 6个白背飞虱 内参基因简并引物，序列如下： (3)确定白背飞虱内参基因序列：简并引物PCR扩增获得序列进行克隆并测序，将 获得序列与NCBI数据库进行Blast比对，以确定内参基因序列，见SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :8 ; (4)设计特异性的荧光定量引物：基于获得白背飞虱9个内参基因序列，设计特异 性荧光定量PCR引物，并利用定量PCR溶解曲线法确定其扩增特异性，并设置10倍梯度稀 释建立标准曲线，确立每对引物的扩增效率； (5)提取白背飞虱1龄、2龄、3龄、4龄、5龄、雄性成虫和雌性成虫总RNA，分别反 转录合成cDNA进行实时荧光定量PCR分析； (6)将实时荧光定量PCR实验数据输入到在线分析软件Ref inder进行内参基因稳 定性分析，确立最稳定表达的内参基因。 步骤（3)中 PCR 扩增的反应条件如下：94 °C，3min，（94 °C，30sec，55 °C， 30sec, 72°C，lmin) 35 个循环，72°C延伸 lmin，4°C保存。 步骤（3)中核苷酸片段的克隆方法，包括以下步骤： 纯化步骤（2)所得PCR产物，琼脂凝胶回收目的片段，取纯化产物连接到pEASY-T 载体上，然后转化大肠杆菌感受态细胞DH5 α中，37°C平板培养过夜，蓝白斑筛选含目的片 段的阳性克隆菌株，对所获得的阳性克隆进行序列测序，测序所得的序列与NCBI数据库进 行BLAST比较分析，进而确定所得的核苷酸序列为白背飞虱内参基因序列。 所述步骤⑷的方法为：提取白背飞虱的总RNA，反转录获得CDNA，然后以CDNA为 模板进行qPCR扩增，荧光染料为SYBR Green I 〇 所述的qPCR扩增采用两步法，即95°C预变性15min，PCR反应为95°C，10sec， 60°C，32sec，40个循环，最后是溶解曲线分析，步骤为：95°C，15sec，60°C lmin，95°C， 30sec,G0°G,15sec。 白背飞虱不同龄期稳定表达的内参基因 AlTU作为内参基因在研宄不同龄期基因 表达水平中的应用。 本专利技术采用以下技术方案： 选取同一饲养条件（27±1°C，75±5%，光周期为16h光照：8h黑暗）下不同龄 期的白背飞虱1龄、2龄、3龄、4龄、5龄、雄性成虫和雌性成虫，提取总RNA，反转录合成 cDNA。然后进行荧光定量PCR验证9个内参基因稳定性情况，筛选出白背飞虱不同龄期中 最稳定的内参基因。这9个内参基因包括：延伸因子l-α (Elongation factor 1-alpha， EF1A)、泛素（Polyubiquitin，UB)、核糖体蛋白 S18(Ribosomal protein S18，RPS18)、 肌动蛋白仏(^111，八(：1'預)、€1-1微管蛋白（八1?11&-1-七1*111111，六11^)、3-磷酸甘油醛 (Glyceraldehyde-3-phosphate，GAPDH)、核糖体蛋白 L9(Ribosomal protein L9，RPL9)、 核糖体蛋白 L10(Ribosomal protein L10，RPL10)和 18SrRNA(18S)。其中本文档来自技高网...

【技术保护点】
白背飞虱不同龄期稳定表达的内参基因A1TU，其核苷酸序列为SEQ ID NO：2。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：刘玉娣，安兴奎，侯茂林，
申请(专利权)人：中国农业科学院植物保护研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11