本发明专利技术公开了一种叶酸需求遗传检测试剂盒及其应用。该试剂盒包括：以CBS基因的699C>T位点、DHFR基因的c.594+59del19位点、GST01基因的428C>A位点、MTHFD基因的1958G>A位点、MTHFR基因的1298A>C位点、MTHFD基因的677C>T位点、MTR基因的-186T>G位点，905G>A位点和2756A>G位点、MTRR基因的c.56+781A＞C位点和66A>G位点、NFE2L2基因的ins1+11108C>T位点、NOS3基因的894G>T位点、RFC1基因的80G>A、TCN2基因776C>G和TYMS基因1494del6等十六个基因突变位点为检测对象而设计的PCR扩增引物和延伸引物，其序列分别如SEQIDNo.1～SEQIDNo.48示；以及，PCR反应试剂，包括聚合酶及缓冲溶液。本发明专利技术提供了一种简单、高通量、高效能、低成本的适合中国人群的叶酸利用能力基因突变筛查方法。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术特别是涉及，属于基因工程技术领 域。
技术介绍
叶酸是人体必不可少的营养物质，其主要生物学功能是作为甲基供体参与细胞 内的甲基化反应和脱氧核糖核酸的合成，叶酸不能被人体直接利用，必需通过一系列活化 才能发挥其生理功能，而从食物中摄取的叶酸只有在叶酸还原酶的作用下还原为四氢叶 酸，才能参与人体许多重要的生化代谢反应，叶酸缺乏是导致胚胎发育异常的环境因素之 一。研宄表明，人群中叶酸缺乏会导致胎儿先天性异常，特别是神经管畸形（Neural tube defectsNTDs)的发生，也可以导致其他出生缺陷的发生率，例如先天性心脏病、唇腭裂、以 及唐氏综合征等，并可使胚胎发生严重多发畸形，导致胚胎在发育早期即死亡，此外，叶酸 缺乏还可以引起早产、流产等不良妊娠的发生。男性缺乏叶酸可以降低精子数量和活力。 在孕妇中大力推广"叶酸强化"，从某种程度上可减少出生缺陷的发生。孕妇一般 采用每天服用一粒叶酸片（400微克）的形式补充叶酸，对于叶酸利用能力正常的孕妇这个 用量是充足的，但对于叶酸代谢异常的孕妇却远远不够。此外，最近发现"叶酸强化"还存 在一定负面效应，大范围人群大量补充叶酸，人为地造成未来的人口对于大量维生素产生 依赖性，由此，可能导致人口整体的基因组成发生变化，这种人群对于某些致命的疾病将变 得十分脆弱。因此，鉴别出叶酸利用能力正常和叶酸利用能力不足的人群，个性化合理的补 充叶酸具有重要的现实意义和长远意义。 部分叶酸利用能力不足的孕妇，其叶酸代谢途径相关酶基因发生了突变，导致了 酶分子一个氨基酸的替换，使酶活性大大下降而影响叶酸的利用能力。已经报道叶酸代谢 途径中一些酶基因的多态性与神经管畸形、心血管疾病、唐氏综合征、流产、淋巴细胞性白 血病、乳腺癌、胃癌、Andesophageal肿瘤、阿尔茨海默病等疾病相关联。 在叶酸利用能力相关的基因检测技术临床应用之前，妇产科医师通常只能建议所 有孕妇按照标准量、标准时间来服用叶酸。 目前，传统基因突变检测方法包括：单链构象多态性分析（Single Strand Conformation Polymorphism，SSCP)、PCR-限制性片段长度多态性（Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP)、变性高效液相色谱（Denaturing High Performance Liquid Chr〇mat〇graphy，DHPLC)、荧光定量PCR法（含融解曲线法）、直接测序、基因芯片等。这些 方法或者检测能力有限、或者耗时费力、所需设备和耗材昂贵，更重要的是，除基因芯片外， 这些方法难以针对不同基因的多个突变位点同时进行高通量检测。而基因芯片技术平台成 本昂贵，对环境和人员素质要求高，难以在我国广大医疗机构中普及，因此有必要建立一种 高通量、高效能、低成本的叶酸代谢相关酶基因突变筛查方法，以实现临床快速检测和规模 化筛查。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术的主要目的在于提供一种叶酸需求遗传检测试剂 盒，其包括： 以 CBS 基因的 699C>T 位点、DHFR基因的 c. 594+59de 119 位点、GST01 基因的 428C>A 位点、MTHFD基因的1958G>A位点、MTHFR基因的1298A>C位点、MTHFD基因的677C>T位点、 MTR基因的-186T>G位点，905G>A位点和2756A>G位点、MTRR基因的c. 56+781A > C位点 和66A>G位点、NFE2L2基因的insl+11108C>T位点、N0S3基因的894G>T位点、RFC1基因的 80G>A、TCN2基因776C>G和TYMS基因1494del6等十六个基因突变位点为检测对象而设计 的PCR扩增引物和延伸引物，其中， 所述检测CBS基因的699C>T位点的扩增引物序列如SEQ ID No. 1与SEQ ID No. 2 所示， 所述检测DHFR基因c. 594+59dell9位点的扩增引物序列如SEQ ID No. 3与SEQ ID No. 4 所示， 所述检测GST01基因的428C>T位点的扩增引物序列如SEQ ID No. 5与SEQ ID No. 6所示， 所述检测MTHFD基因1958G>A位点的扩增引物序列如SEQ ID No. 7与SEQ ID No. 8 所示， 所述检测MTHFR基因1298A>C位点的扩增引物序列如SEQ ID No. 9与SEQ ID No. 10所示， 所述检测MTHFD基因677C>T位点的扩增引物序列如SEQ ID No. 11与SEQ ID No. 12所示， 所述检测MTR基因2756A>G位点的扩增引物序列如SEQ ID No. 13与SEQ ID No. 14 所示， 所述检测MTR基因的-186T>G位点的扩增引物序列如SEQ ID No. 15与SEQ ID No. 16所示， 所述检测MTR基因的905G>A位点的扩增引物序列如SEQ ID No. 17与SEQ ID No. 18所示， 所述检测MTRR基因66A>G位点的扩增引物序列如SEQ ID No. 19与SEQ ID No. 20 所示， 所述检测MTRR基因c. 56+781A > C位点的扩增引物序列如SEQ ID No. 21与SEQ ID No. 22 所示， 所述检测NFE2L2基因insl+11108C>T位点的扩增引物序列如SEQ ID No. 23与 SEQ ID No. 24 所示， 所述检测N0S3基因的894G>T位点的扩增引物序列如SEQ ID No. 25与SEQ ID No. 26所示， 所述检测RFC1基因80G>A位点的扩增引物序列如SEQ ID No. 27与SEQ ID No. 28 所示， 所述检测TCN2基因776C>G位点的扩增引物序列如SEQ ID No. 29与SEQ ID No. 30 所示， 所述检测TYMS基因1494del6位点的扩增引物序列如SEQ ID No. 31与SEQ ID No. 32所示， 以及，PCR反应试剂，包括聚合酶及缓冲溶液。 其中，所述PCR反应试剂包括dNTP、5X和10XPCR缓冲液、Mg2+离子、FastTaq酶、 SNaPshot Mix混合液。还包括主要由SAP酶、Exon I酶与配套缓冲液组成的纯化试剂。还 可包括单个位点纯合、杂合突变的阳性对照标本和/或阴性对照标本。 进一步地，以CBS基因的699C>T位点、DHFR基因的c. 594+59dell9位点、GST01基 因的428C>A位点、MTHFD基因的1958G>A位点、MTHFR基因的1298A>C位点、MTHFD基因的 677C>T位点、MTR基因的-186T>G位点，905G>A位点和2756A>G位点、MTRR基因的c. 56+781A > C位点和66A>G位点、NFE2L2基本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种叶酸需求遗传检测试剂盒，其特征在于包括：以CBS基因的699 C>T位点、DHFR基因的c.594+59del19位点、GST01基因的428C>A位点、MTHFD基因的1958 G>A位点、MTHFR基因的1298 A>C位点、MTHFD基因的677 C>T位点、MTR基因的‑186 T>G位点，905 G>A位点和2756 A>G位点、MTRR基因的c.56+781 A＞C位点和66 A>G位点、NFE2L2基因的ins1+11108 C>T位点、NOS3基因的894 G>T位点、RFC1基因的80 G>A、TCN2基因776 C>G和TYMS基因1494del6等十六个基因突变位点为检测对象而设计的PCR扩增引物和延伸引物，其中，所述检测CBS基因的699 C>T位点的扩增引物序列如SEQ ID No.1与SEQ ID No.2所示，所述检测DHFR基因c.594+59del19位点的扩增引物序列如SEQ ID No.3与SEQ ID No.4所示，所述检测GST01基因的428 C>T位点的扩增引物序列如SEQ ID No.5与SEQ ID No.6所示，所述检测MTHFD基因1958 G>A位点的扩增引物序列如SEQ ID No.7与SEQ ID No.8所示，所述检测MTHFR基因1298 A>C位点的扩增引物序列如SEQ ID No.9与SEQ ID No.10所示，所述检测MTHFD基因677 C>T位点的扩增引物序列如SEQ ID No.11与SEQ ID No.12所示，所述检测MTR基因2756 A>G位点的扩增引物序列如SEQ ID No.13与SEQ ID No.14所示，所述检测MTR基因的‑186 T>G位点的扩增引物序列如SEQ ID No.15与SEQ ID No.16所示，所述检测MTR基因的905 G>A位点的扩增引物序列如SEQ ID No.17与SEQ ID No.18所示，所述检测MTRR基因66 A>G位点的扩增引物序列如SEQ ID No.19与SEQ ID No.20所示，所述检测MTRR基因c.56+781 A＞C位点的扩增引物序列如SEQ ID No.21与SEQ ID No.22所示，所述检测NFE2L2基因ins1+11108 C>T位点的扩增引物序列如SEQ ID No.23与SEQ ID No.24所示，所述检测NOS3基因的894 G>T位点的扩增引物序列如SEQ ID No.25与SEQ ID No.26所示，所述检测RFC1基因80G>A位点的扩增引物序列如SEQ ID No.27与SEQ ID No.28所示，所述检测TCN2基因776C>G位点的扩增引物序列如SEQ ID No.29与SEQ ID No.30所示，所述检测TYMS基因1494del6位点的扩增引物序列如SEQ ID No.31与SEQ ID No.32所示，以及，PCR反应试剂，包括聚合酶及缓冲溶液。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：陈瑛，王本敬，
申请(专利权)人：陈瑛，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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