本发明专利技术提供了一种基于目标触发的双重信号扩增的探针，所述探针包括第一发夹、第二发夹和第三发夹，第一发夹、第二发夹以及第三发夹均为单链线形分子自身回折后，折叠区域内的互补碱基配对杂交而成，其局部区域形成双链结构的部分为茎干区，未形成双链结构并回折的部分为环状区。本发明专利技术的探针通过目标蛋白质催化上述发夹自组装，并在外切酶Ⅲ辅助下达到信号扩增，实现检测信号的明显放大，进而大幅的提高了检测的灵敏性，并且由于其在检测过程中不依赖于模板复制，避免了在检测过程中出现交叉污染，进而导致假阳性出现的问题，有效的防止了假阳性信号的产生，大大减小了背景噪声。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子生物信息学领域，具体涉及一种基于目标触发的双重信号扩增的 探针及其检测蛋白质的方法和应用。
技术介绍
蛋白质的定量检测在生物研宄和药物诊断领域起着非常重要的作用。然而，由于 蛋白质经常处于非常低的浓度，往往需要高灵敏的分析检测法才能将其检测出来，因此能 够对蛋白质分子高灵敏性、高选择性、简单快捷的检测一直是人们研宄的方向。目前，在蛋 白质的定量检测方法中，酶联免疫吸附试验（ELISA)是最常用的方法，该方法虽然可以达 到定量分析的目的，但受酶-底物反应的限制，其检测灵敏度仍无法对微量的蛋白质分子 进行检测，因而限制了其在疾病早期诊断中的应用价值，又由于其操作步骤比较复杂，导 致影响结果的因素较多，如操作时间和操作过程要求比较严格；线性范围较窄；特异性较 差，血清中各种物质的干扰会影响反应结果；阴阳性的界定比较模糊，需要重复试验；手工 操作繁琐，难以自动化和批量化；不同批次的反应差异较大，结果难归一化。因此，现在经 常将信号扩增策略用于蛋白质分子检测的生物传感器的构建中。在过去的几十年里，相 当一部分的扩增策略已被结合到蛋白质的检测中，例如聚合酶链反应（PCR)，连接酶链反 应（LCR)，滚环扩增（RCA)。这些扩增技术极大地提高了蛋白质检测的灵敏性，但由于他们 严重依赖于模板复制，增加了在扩增过程中出现交叉污染的风险，导致假阳性结果的出现 (J. Dong, X. Cui, Y. Deng, Z. Tang, Biosens. Bioelectron.，2012)。所以，对于蛋白质传感扩 增策略的开发仍然是需要进一步的探索研宄。 最近，目标催化发夹自组装作为一种有前景的酶免信号扩增策略被报道用于生物 分子的检测，而依据酶免信号扩增策略设计的光学生物传感器中常常使用到DNA酶。DNA酶 (也称脱氧核酶或催化DNA)是单链寡脱氧核苷酸，具有催化化学反应的能力，与传统的蛋 白质酶相比较，DNA酶具有高的热稳定性，核酸合成的简易性，将识别区域编入DNA酶序列 的灵活性，这些性质使得DNA酶成为生物传感的理想选择。在过去十年里，G-四链体DNA酶 已被广泛地设计应用到许多的光学生物传感器。G-四链体可以结合辅因子氯化血红素，形 成G-四链体/氯化血红素DNA酶，在H 202介导下催化氧化5-氨基-2, 3-二氯-1，4-苯二 甲酰肼（鲁米诺），2, 2' -联氮-双（3-乙基苯并噻唑-6-磺酸）（ABTS2》，或硫胺素，并伴 随有化学光发射，颜色改变或荧光发射。因此，基于G-四链体DNA酶建立起了化学发光，比 色或荧光的生物传感系统。其中，化学发光检测引起了更多的关注，这主要取决于其操作简 便，灵敏度高，并且不需要昂贵的分析仪器。至今，一些基于该策略的生物传感器被成功地 开发出来，然而这其中大部分的生物传感器主要针对于核酸的检测。 如，中国专利文献CN102827836A公开了一种寡核苷酸探针以及用其对靶分子进 行检测的方法，上述探针为基于靶分子设计的具有粘性末端的DNA-对发夹序列，实质是 杂交链式反应的发夹序列与G-四链体序列相结合的产物。当反应体系中不存在靶分子时， 两个发夹序列保持亚稳态的发夹结构；当反应体系中存在靶分子时，靶分子便可与第一个 发夹序列特异性结合，破坏其二级结构并释放剩余的G-四链体序列，第一个发夹释放的自 由的G-四链体序列可与第二个发夹序列杂交，破坏第二个发夹并释放出与靶分子具有相 同作用的核酸序列，也可与第一个发夹的靶分子特异性识别部分特异性结合，从而导致两 个发夹级联杂交，如此周而复始，最终形成类似双链DNA的大分子聚合物，被释放的大量自 由的G-四链体序列即可与氯化血红素（hemin)结合，催化氧化H 202介导的ABTS，从而检测 靶分子。但是上述探针检测靶分子时，存在以下问题： (1)背景噪声较大、灵敏度较差。具体而言，在反应体系中，发夹结构与未形成发 夹结构的直链是保持动态平衡的，直链未形成闭合的环而被保护，导致G-四链体序列并不 全是靶分子打开第一个发夹而释放、进而与第二个发夹杂交形成的，也有部分是直链的序 列与第二个发夹直接杂交，从而形成自由的G-四链体序列的，因此无法实现较为灵敏的检 测； (2)利用碱基的杂交配位进行靶分子的检测，实际上仅能实现DNA的检测，而无法 实现蛋白质的检测。 鉴于此，目前亟待提出一种操作简单、成本低、低背景噪声同时具有高灵敏度的检 测蛋白质分子的探针。
技术实现思路
为此，本专利技术所要解决的技术问题在于现有技术中用于检测蛋白质分子的探针灵 敏度低，背景噪声大，进而提供一种灵敏度高、低背景噪声的基于目标触发的双重信号扩增 的探针。 本专利技术所要解决的第二个技术问题在于现有技术中对蛋白质的检测方法耗时长、 操作复杂和成本高，进而提供一种操作简单、低成本的检测蛋白质分子的方法。 为解决上述技术问题，本专利技术提供了一种基于目标触发的双重信号扩增的探针， 包括第一发夹、第二发夹和第三发夹；所述第一发夹、第二发夹以及第三发夹均为单链线形 分子自身回折后，折叠区域内的互补碱基配对杂交而成，其局部区域形成双链结构的部分 为茎干区，未形成双链结构并回折的部分为环状区。 所述的基于目标触发的双重信号扩增的探针，所述第一发夹包括：可特异性识别 目标蛋白质的适配体区（I)以及与所述适配体区（I)部分杂交形成发夹结构的第一茎 干区（II); 所述第二发夹包括：可与所述第一发夹的适配体区（I )部分杂交的第一碱基互 补区（I '）、可与所述第一茎干区（II)杂交的第二碱基互补区（II'），以及与所述第一碱 基互补区（I '）和第二碱基互补区（II'）部分杂交形成发夹结构的第二茎干区（III); 所述第三发夹包括：可与所述第二茎干区（III)部分杂交的第三碱基互补区 (III'）以及与所述第三碱基互补区（III'）部分杂交形成发夹结构的G-四链体序列区（IV)。 所述的基于目标触发的双重信号扩增的探针，所述第一茎干区（II )和所述第二 茎干区（III)的3'端为不易被外切酶剪切的稳定序列。 所述的基于目标触发的双重信号扩增的探针，所述第一茎干区（II )为从3'端开 始的第1_4碱基为T-T-T-T的序列；所述第二莖干区（II )为从3'端开始的第1-4碱基为 T-T-A-A的序列。 所述的基于目标触发的双重信号扩增的探针，所述第一茎干区（II )的5'端部分 序列与所述适配体区（I )3'端连接形成所述第一发夹的环状区。 所述的基于目标触发的双重信号扩增的探针，所述第一茎干区（II )的5'端位于 所述环状区的部分为从3'端开始的第1-4碱基为T-T-T-T的序列。 所述的基于目标触发的双重信号扩增的探针，所述G-四链体序列区（IV )具有如 SEQIDNo.1所示的序列结构。 本专利技术还提供了一种检测蛋白质分子的方法，利用所述的基于目标触发的双重信 号扩增的探针进行荧光检测。 所述的方法，包括如下步骤： 分别取所述的基于目标触发的双重信号扩增的探针和外切酶III加入到待测溶液 中，20-40°C下孵育80-100分钟，随后向其中加入氯化血红素和HEPES缓冲液，20-40°C下孵 育50-70分钟，然后向其中加入鲁米诺和H 2本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种基于目标触发的双重信号扩增的探针，其特征在于，包括第一发夹、第二发夹和第三发夹；所述第一发夹、第二发夹以及第三发夹均为单链线形分子自身回折后，折叠区域内的互补碱基配对杂交而成，其局部区域形成双链结构的部分为茎干区，未形成双链结构并回折的部分为环状区。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：吴昊，邹霈，诸飞帆，刘娅灵，王洪勇，吴军，
申请(专利权)人：江苏省原子医学研究所，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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