实时荧光定量PCR定位基因转录起始位点和PolyA位点的方法技术

本发明专利技术公开了一种实时荧光定量PCR定位基因转录起始位点和PolyA位点的方法及其应用，方法包括以下步骤：S1：在待测基因的编码区的任意区段设计一对实时定量PCR引物作为对照引物；S2：对待测基因的转录起始位点进行定位：启动子区自起始密码子起，每隔第一预定个数的碱基对设计一对第一引物，第一引物的扩增片段大小为第二预定个数的碱基对，并向上游步移预定距离；S3：对待测基因的PolyA位点进行定位：自终止密码子起，每隔第一预定个数的碱基对设计一对第二引物，第二引物的扩增片段大小为第二预定个数的碱基对，并向下游步移预定距离；S4：对对照引物、第一引物和第二引物进行扩增，并对扩增片段进行特异性分析，确定待测基因的转录起始位点和PolyA位点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及基因转录
，更具体地，涉及一种实时荧光定量PCR定位基因转录起始位点和PolyA位点的方法及其应用。
技术介绍
真核生物的DNA转录发生在细胞核中，是遗传信息由DNA转换到RNA的过程，包括启动、延伸和终止阶段。在起始阶段，RNA聚合酶在σ亚基引导下识别并结合到启动子上，形成由酶、DNA和核苷三磷酸(NTP)构成的三元起始复合物。在延伸阶段，核心酶沿着DNA分子向前移动，随着碱基的加入，新生的RNA链不断生长。在转录终止阶段，RNA聚合酶在Nus A因子帮助下识别转录终止信号，停止转录，RNA链离开模板。此时生成的mRNA称为前体mRNA，须经过一系列转录后加工过程并转移到细胞质中才能表现出翻译功能。mRNA的加工过程主要包括加帽(5’端形成特殊的帽子结构)，加尾(3’端切断并加上多聚腺甘酸尾巴)、剪接(去除内含子并拼接外显子)和甲基化(链内核苷酸甲基化)。真核生物的mRNA都有5’帽子结构，即在转录起始后不久在5’端三磷酸脱去一个磷酸，然后与GTP反应生成5’,5’-三磷酸相连的键，并释放出焦磷酸，最后以S-腺甘蛋氨酸(SAM)进行甲基化产生帽子结构。5’帽子有助于mRNA穿过核膜，保护5’端不被降解以及翻译起始阶段时供eIF4E识别等作用；5’非翻译区(5’Untranslated region，5’UTR)在AUG附近含有核糖体结合位点，核糖体在此组装。真核生物的前体mRNA通常还含有终止密码子下>游0.1-9kb长的序列，核酸内切酶在PolyA位点上切除多余序列，并在PolyA聚合酶的作用下添加20-200个腺甘酸残基，形成多聚腺甘酸的尾巴结构。多聚腺甘酸的尾巴具有增强mRNA的稳定性、控制mRNA的亚细胞定位和指导特定氨基酸的编码等作用。完整的基因转录本包括5’UTR、编码区和3’UTR。全基因组测序提供了大量的DNA序列，要从中将遗传信息解读出来首先要识别基因，特别是基因转录调控信息。通常情况下，先利用软件如GRAIL、FGENEH、WebGene、GENSCAN对全基因进行扫描，然后再用RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends，RACE)技术克隆基因的非翻译区，从而确定转录起始位点和PolyA位点。CLONTECH开发的5’-Full RACE kit(货号：D315)基于去帽子原理克隆cDNA 5’末端的完整序列，3’-Full RACE Core Set with PrimerScript RTase(货号：D314)使用改良的PrimeScript反转录酶克隆cDNA 3’末端的完整序列。其原理是将目的基因的5’非翻译区的5’端和3’非翻译区的3’端连上接头，在接头的不同部位设计一条外侧引物和一条内侧引物(公司提供)，再在基因编码区设计对应的外侧和内侧引物(用户自备)，利用套式PCR克隆cDNA的5’非翻译区和3’非翻译区。但是任何克隆技术都不能从根本上解决特异性差和扩增效率低下的问题。尽管RACE试剂盒采用两轮PCR扩增以提高目的片段的特异性，但是由于每对引物中要有一条引物与接头配对，导致实际只有用户自备的两条与编码区配对的引物参与筛选，仅相当于一次普通PCR，因此不可避免地出现非特异性扩增。未知基因的非翻译区长度很难利用软件准确预测，更加大了克隆的难度，如果能够确认目的片段的长度，就可以通过改变PCR反应条件来提高特异性，例如改变引物退火温度、延伸时间和控制模板的量等。扩增效率低下是目前所有PCR扩增都面临问题，片段越长，扩增效率越低。同一物种中非翻译区长度变化很大，从十几个碱基到数千个碱基不等，例如Mignone等人(2002)分析了5464个无脊椎动物5’UTR，最长的为4498bp；3736个3’UTR，最长的为9142bp。在理想状态下，5’-Full RACE kit(货号：D315)最长也仅能得到3.2kb的PCR扩增产物(见D315技术手册)；而实际情况下，500bp以上的片段扩增效率明显下降，克隆难度增加。
技术实现思路
本专利技术旨在至少在一定程度上解决上述技术问题之一。为此，本专利技术的一个目的在于提出一种实时荧光定量PCR定位基因转录起始位点和PolyA位点的方法，该方法使用范围宽，灵敏度和精确度高。本专利技术还提出一种实时荧光定量PCR定位基因转录起始位点和PolyA位点的方法在检测试剂盒中的应用。根据本专利技术第一方面实施例的实时荧光定量PCR定位基因转录起始位点和PolyA位点的方法，包括以下步骤：S1：在待测基因的编码区的任意区段设计一对实时定量PCR引物作为对照引物；S2：对所述待测基因的转录起始位点进行定位：启动子区自起始密码子起，每隔第一预定个数的碱基对设计一对第一引物，所述第一引物的扩增片段大小为第二预定个数的碱基对，并向上游步移预定距离；S3：对所述待测基因的PolyA位点进行定位：自终止密码子起，每隔第一预定个数的碱基对设计一对第二引物，所述第二引物的扩增片段大小为第二预定个数的碱基对，并向下游步移预定距离；S4：对所述对照引物、第一引物和第二引物进行扩增，并对扩增片段进行特异性分析，确定所述待测基因的转录起始位点和PolyA位点。根据本专利技术实施例的实时荧光定量PCR定位基因转录起始位点和PolyA位点的方法，用qRT-PCR技术同时检测基因不同区段的表达丰度，对转录起始位点和PloyA位点进行精确定位，解决目的基因非翻译区长度不确定性问题，使RACE克隆过程中的引物设计摆脱对编码区的依赖，将设计位点前移到起始位点和PloyA位点附近，只需扩增500bp以内的小片段，就可以克隆出非翻译区，该方法使用范围宽泛，并且定位的灵敏度和准确度高。另外，根据本专利技术上述实施例的实时荧光定量PCR定位基因转录起始位点和PolyA位点的方法，还可以具有如下附加的技术特征：根据本专利技术的一个实施例，所述第一预定个数为180-220，所述第二预定个数为50-250，所述预定距离为1000-8000个碱基对。根据本专利技术的一个实施例，所述对照引物、第一引物和第二引物的长度均为18-25个碱基对。根据本专利技术的一个实施例，所述对照引物、第一引物和第二引物的退火温度为60-65℃，GC含量为40-60％。根据本专利技术的一个实施例，所述对照引物、第一引物和第二引物的退火温度差小于等于2℃。根据本专利技术的一个实施例，所述对照引物、第一引物和第二引物的退火温度相等。根据本专利技术的一个实施例，所述转录起始位点定位的对照引物和第一引物的模板量相同，所述P本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种实时荧光定量PCR定位基因转录起始位点和PolyA位点的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1：在待测基因的编码区的任意区段设计一对实时定量PCR引物作为对照引物；S2：对所述待测基因的转录起始位点进行定位：启动子区自起始密码子起，每隔第一预定个数的碱基对设计一对第一引物，所述第一引物的扩增片段大小为第二预定个数的碱基对，并向上游步移预定距离；S3：对所述待测基因的PolyA位点进行定位：自终止密码子起，每隔第一预定个数的碱基对设计一对第二引物，所述第二引物的扩增片段大小为第二预定个数的碱基对，并向下游步移预定距离；S4：对所述对照引物、第一引物和第二引物进行扩增，并对扩增片段进行特异性分析，确定所述待测基因的转录起始位点和PolyA位点。

【技术特征摘要】
1.一种实时荧光定量PCR定位基因转录起始位点和PolyA位点的方法，其特征在于，
包括以下步骤：
S1：在待测基因的编码区的任意区段设计一对实时定量PCR引物作为对照引物；
S2：对所述待测基因的转录起始位点进行定位：启动子区自起始密码子起，每隔第一
预定个数的碱基对设计一对第一引物，所述第一引物的扩增片段大小为第二预定个数的碱
基对，并向上游步移预定距离；
S3：对所述待测基因的PolyA位点进行定位：自终止密码子起，每隔第一预定个数的
碱基对设计一对第二引物，所述第二引物的扩增片段大小为第二预定个数的碱基对，并向
下游步移预定距离；
S4：对所述对照引物、第一引物和第二引物进行扩增，并对扩增片段进行特异性分析，
确定所述待测基因的转录起始位点和PolyA位点。
2.根据权利要求1所述的实时荧光定量PCR定位基因转录起始位点和PolyA位点的方
法，其特征在于，所述第一预定个数为180-220，所述第二预定个数为50-250，所述预定
距离为1000-8000个碱基对。
3.根据权利要求1所述的实时荧光定量PCR定位基因转录起始位点和PolyA位点的方
法，其特征在于，所述对照引物、第一引物和第二引物的长度均为18-25个碱基对。
4.根据权利要求1所述的实时荧光定量PCR定位基因转录起始位点和PolyA位点的方
法，其特征在...

【专利技术属性】
技术研发人员：李小辉，姜培红，晏月明，
申请(专利权)人：首都师范大学，
类型：发明
国别省市：北京;11