本发明专利技术公开了一种用于高效构建无抗性标记重组分枝杆菌的抗性表达盒。该抗性表达盒含有精简后的潮霉素抗性基因（SEQ?ID?NO:1所示），以及位于潮霉素抗性基因两端的dif1和dif2序列。本发明专利技术精简后的Hyg基因序列由原来的1.7kb缩短至1kb左右，去掉了转录终止子，较长的天然启动子等复杂结构，便于PCR扩增，内部酶切位点更少（常见酶切位点已被定点突变掉），同时，Hyg自带短的人工启动子，在大肠杆菌和分枝杆菌中均可表达，定向插入时不影响下游基因的转录和翻译。本发明专利技术的抗性表达盒在精简后的Hyg基因两端添加了dif序列，可以在分枝杆菌中自动解离。Hyg基因丢失后，被破坏的基因仍可继续表达缩短的小肽，不影响下游基因的翻译，从而可有效避免极性效应。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了一种用于高效构建无抗性标记重组分枝杆菌的抗性表达盒。该抗性表达盒含有精简后的潮霉素抗性基因（SEQ?ID?NO:1所示），以及位于潮霉素抗性基因两端的dif1和dif2序列。本专利技术精简后的Hyg基因序列由原来的1.7kb缩短至1kb左右，去掉了转录终止子，较长的天然启动子等复杂结构，便于PCR扩增，内部酶切位点更少（常见酶切位点已被定点突变掉），同时，Hyg自带短的人工启动子，在大肠杆菌和分枝杆菌中均可表达，定向插入时不影响下游基因的转录和翻译。本专利技术的抗性表达盒在精简后的Hyg基因两端添加了dif序列，可以在分枝杆菌中自动解离。Hyg基因丢失后，被破坏的基因仍可继续表达缩短的小肽，不影响下游基因的翻译，从而可有效避免极性效应。【专利说明】一种用于高效构建无抗性标记重组分枝杆菌的抗性表达盒
本专利技术属于基因工程领域，具体涉及一种用于高效构建无抗性标记重组分枝杆菌的抗性表达盒及其应用。
技术介绍
Mtb是引起结核病的病原菌，可侵犯全身各器官，但以肺结核为最多见。结核病至今仍为重要的传染病，其诊断，预防和治疗研究进展缓慢。这3个方面均涉及到研究Mtb基因的功能，而对Mtb进行遗传改造在Mtb的研究中起着举足轻重的作用。结核分枝杆菌生长缓慢，难于对其进行遗传操作，需要昂贵的带负压的3级生物安全实验室，长时间培养不仅占用空间而且容易污染等等使结核分枝杆菌的研究耗时耗财耗力。以抗Mtb药物的研发为例，抗Mtb药物的研发昂贵且周期长。近半个世纪以来，直到2012年底刚刚有一种新作用机制的药物问世，且具有潜在的毒力。目前研究抗Mtb药物/疫苗最核心的问题之一就是建立有效，快速和廉价的基因工程菌。目前在对分枝杆菌进行基因操作的过程中，仅有卡那霉素抗性基因和潮霉素抗性基因比较有效。因此，进行分枝杆菌突变株的研究时，如果所用菌株具有抗性基因，这会对以后的遗传操作带来不便。例如，基因敲除/遗传互补至少需2种抗性基因；遗传重组技术(recombineering)也需要2种抗性基因等。同时，在分枝杆菌中，有时需要表达多种抗原蛋白，需要多次遗传操作，因 此，产生无抗性重组菌株对后续操作尤为重要。可利用基因敲除技术用抗性基因将靶基因替换，但是基因敲除时还常常用到噬菌体包装技术。该技术需要将靶基因上游序列+抗性基因+靶基因下游序列(简称三片段)一起包装到噬菌体中，形成噬粒。三片段总长度有一定的限制，如果过长，将不能被包装到噬菌体，无法获得用于基因敲除的噬粒。由于包装有容量有限制，如果抗性基因短小，则可以适当增加靶基因上游序列+靶基因下游序列的长度，甚至可以加入其它元件，因此，有利于适当增加噬菌体包装的有效DNA片段长度。基因敲除后，最有效的检测方法之一是进行PCR验证，然而，以往的//汉基因具有的转录终止子具有复杂的二级结构使PCR很难进行。有专利技术将Zfes等序列加到Hyg两侧，而Res等序列需要人工表达一种外源蛋白来识别并作用后才可将?解离。即实际操作中，先将带的序列的质粒导入分枝杆菌,等筛选到序列插入基因组后的分枝杆菌，再导入另外一个可以表达解离蛋白的质粒，再经过筛选，可以得到?丢失的分枝杆菌。许多实验往往还需要继续筛选表达解离蛋白的质粒丢失的菌株。因此，非常繁琐，费时费力。有些类似的系统在分枝杆菌中抗性基因丢失的效率极低。dif序列加到Hyg两侧便于?基因的解离，最近几年才见报道。其优势在于，不需要人工表达外源蛋白来实现抗性基因的解离，因为分枝杆菌本身就编码这样的蛋白，因此，省去了很多不必要的麻烦。而且该系统的效率非常高，兼容性好(例如，慢速生长的结核分枝杆菌的i/i/序列在快速生长的耻垢分枝杆菌中同样起作用)。然而，在采用i/i/序列体系的研究中，其所用?抗性基因，片段长(1.7kb)，带有复杂的3’端2级结构，内部有常见的酶切位点，两端可用酶切位点少，且构建的抗性表达盒不能够“通用”。所以，如果能够构建在分枝杆菌中带有自动解离功能的更短小、易于遗传操作的带有多克隆位点的通用抗性表达盒，且可以不产生极性效应，将会极大简化多种分枝杆菌的遗传操作。在进行分枝杆菌遗传操作时候，因为利用抗性表达盒带入的抗性基因可自动解离，所以后续的遗传操作时将不会受到抗性基因选择的限制，而且，不带抗性基因的突变株也使得多种遗传研究更为可能，将为分枝杆菌的基因工程研究提供强有力的工具。
技术实现思路
本专利技术的一个目的在于提供一种经精简且自带人工启动子的潮霉素抗性基因Hyg0本专利技术的另一个目的在于提供一种用于高效构建无抗性标记重组分枝杆菌的抗性表达盒。本专利技术的另一个目的在于提供一种用于高效构建无抗性标记重组分枝杆菌的重组质粒。本专利技术所采取的技术方案是: 一种精简改造后的潮霉素抗性基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。一种用于高效构建无抗性标记重组分枝杆菌的抗性表达盒，其含有精简改造后的潮霉素抗性基因，以及位于潮霉素抗性基因两端的ΛΥ7和序列，其特征在于，所述精简改造后的潮霉素抗性基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，difl和dif2序列分别如SEQ ID N0:7和SEQ ID N0:8所示。在此将该抗性表达盒命名为抗性表达合”优选的，所述抗性表达盒两端还添加了多重酶切位点。所述抗性表达盒的核苷酸序列如SEQ ID N0:5或SEQ ID N0:6所示。含有以上所述抗性表达盒的重组质粒。优选的，所述重组质粒的核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示。一种用于高效构建无抗性标记重组分枝杆菌的重组质粒，其含有:启动子、噬菌体整合位点、整合酶基因、dif-Ω HYG-?Τ抗性表达盒、复制起始位点。按顺时针方向，噬菌体整合位点、整合酶基因、dif-Ω HYG-?Τ抗性表达盒依次连接在一起。所述启动子为LacZ启动子或BLA启动子,所述复制起始位点为大肠杆菌复制起点。优选的，所述重组质粒的的核苷酸序列如SEQ ID N0:4所示。本专利技术的有益效果是: (I)本专利技术精简后的场叉基因序列由原来的1.7kb缩短至Ikb左右，去掉了转录终止子，较长的天然启动子等复杂结构，便于PCR扩增，内部酶切位点更少(常见酶切位点已被定点突变掉)，同时，Hyg自带短的人工启动子,在大肠杆菌和分枝杆菌中均可表达,定向插入时不影响下游基因的转录和翻译。( 2 )本专利技术的抗性表达盒在精简后的Hyg基因两端添加了 dif序列，可以在分枝杆菌中自动解离。?基因丢失后，被破坏的基因仍可继续表达缩短的小肽，不影响下游基因的翻译，从而可有效避免极性效应。(3)本专利技术的抗性表达盒两端还添加了多重酶切位点，使得该表达盒既可以插入到特定序列中，还便于在其两侧定向添加其他序列。【专利附图】【附图说明】图1为质粒pU⑶HmKE的结构示意图； 图2为质粒pUCDHmKE酶切位点图； 图3为质粒pU⑶HmKE的构建流程图； 图4为整合型质粒pMH94DHmKE的结构示意图； 图5为整合型质粒pMH94DHmKE的构建流程图； 图6为整合质粒pblDHCiGn的结构示意图； 图7为质粒pblDHCiGn的构建流程图； 图8为dif-Ω HYG-?Τ表达盒与以往在分枝杆菌遗传操作中常用的含有潮霉素(HYG)抗性基因0--")的片段的比较简本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种精简改造后的潮霉素抗性基因，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO:1所示。
【技术特征摘要】
...
【专利技术属性】
技术研发人员：张天宇，杨峰，邹文英，
申请(专利权)人：中国科学院广州生物医药与健康研究院，
类型：发明
国别省市：
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