一种重组质粒和重组工程菌及其构建方法和应用技术

本发明专利技术涉及基因工程技术领域，公开了一种重组质粒和重组工程菌及其构建方法和应用。所述重组质粒在基础质粒上包括T7启动子、T7终止子、11位β羟化酶基因CYP11B1、电子传递体基因Adx、电子传递体基因AdR，所述11位β羟化酶能基因CYP11B1、电子传递体基因Adx、电子传递体基因AdR位于T7启动子和T7终止子之间。本发明专利技术为17α‑羟孕酮生物转化为21‑脱氧皮质醇提供优化的外源基因，选取多种来源的11位β羟化酶基因CYP11B1以及电子传递体基因Adx、电子传递体基因AdR，整合至T7启动子和终止子基础质粒上，构建出的重组质粒转化至工程菌中能够实现21‑脱氧皮质醇的高产。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及基因工程
，更具体的说是涉及一种重组质粒和重组工程菌及其构建方法和应用。
技术介绍
微生物转化法是利用微生物细胞产生的一种或者多种酶把一种化合物变成结构相关的更有经济价值的产物，其本质是利用微生物本身所产生的酶对外源底物进行的催化反应。大肠杆菌表达系统是目前最常用的外源蛋白表达系统，大肠杆菌由于遗传背景简单，容易培养，以及由大量可供选择的克隆载体与表达载体，使之成为人们克隆表达外源基因的主要菌株。甾体激素(steroidhormone)，包括肾上腺皮质激素和性激素，它是一类维持生命、保持正常生活、促进性器官发育、维持生育的重要生物活性物质。甾体激素药物是指分子结构中含有甾体结构的激素类药物，是临床上一类重要的药物，主要包括肾上腺皮质激素(adrenocorticohormones)和性激素(sexhormone)两大类。皮质激素类药物用于临床的有醋酸可的松(cortisoneacetate)、氢化可的松(hydrocortisone)等。21-脱氧皮质醇(21-Deoxycortisol，4-Pregnene-11beta,17alpha-diol-3,20-dione，C21H30O4，分子量346.4605)是一种重要的甾体激素，同时也是一种重要的甾体激素合成的中间体，它是由17α-羟孕酮(17α-Hydroxyprogesterone，17alpha-Hydroxy-4-pregnene-3,20-dione，C21H30O3，分子量330.4611)11位被氧化成β构型的羟基而得到。目前还未有生物全合成或者生物转化生成21-脱氧皮质醇的文献及专利发表。因此，在大肠杆菌中将17α-羟孕酮生物转化为21-脱氧皮质醇是一个非常具有前景的能够运用于工业上的技术。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种重组质粒，使得所述重组质粒转化到大肠杆菌中能够将17α-羟孕酮生物转化为21-脱氧皮质醇并具有较高产量，可应用于转化生成21-脱氧皮质醇的重组工程菌的构建中。本专利技术的另一个目的在于提供一种重组工程菌，使得所述重组工程菌能够将17α-羟孕酮生物转化为21-脱氧皮质醇并具有较高产量，可应用于21-脱氧皮质醇的微生物转化中。为实现上述专利技术目的，本专利技术提供如下技术方案：一种重组质粒，在基础质粒上包括T7启动子、T7终止子、11位β羟化酶基因CYP11B1、电子传递体基因Adx、电子传递体基因AdR，所述11位β羟化酶能基因CYP11B1、电子传递体基因Adx、电子传递体基因AdR位于T7启动子和T7终止子之间。本专利技术将11位β羟化酶基因CYP11B1、电子传递体基因Adx、电子传递体基因AdR通过T7启动子和终止子开启表达，由此构建出重组质粒，利用该重组质粒转化到工程菌中可实现将17α-羟孕酮生物转化为21-脱氧皮质醇并具有较高产量。其中，作为优选，所述基础质粒为pET21a质粒，其上包含T7启动子和T7终止子，是一种商品化质粒，在构建时较为方便，本专利技术同时也可使用额外添加T7启动子和T7终止子的其他适合质粒。在本专利技术的具体实施方式中，所述11位β羟化酶基因CYP11B1为人源(Homosapiens)、牛源(BosTaurus)、褐家鼠来源(Rattusnorvegicus)，羊源(Ovisaries)、袋獾来源(Sarcophilusharrisii)、狐蝠源(PteropusAlecto)或日本鬼伞科蘑菇来源(Coprinopsiscinereaokayama7#130)的野生型CYP11B1或突变型CYP11B1；为了方便表述，在本专利技术中可简写为Hs野生型或突变型CYP11B1、Rn野生型或突变型CYP11B1、Bt野生型或突变型CYP11B1、Oa野生型或突变型CYP11B1、Sh野生型或突变型CYP11B1、Pa野生型或突变型CYP11B1、Cc野生型或突变型CYP11B1。在本专利技术的具体实施方式中，所述电子传递体基因Adx、电子传递体基因AdR均为牛源(BosTaurus)基因。作为优选，上述突变型的各来源CYP11B1都将疏水端N端编码23位的氨基酸突变成为了编码亲水性精氨酸的核苷酸序列，具体所述人源、牛源、褐家鼠来源，羊源、袋獾来源、狐蝠源以及日本鬼伞科蘑菇来源的突变型CYP11B1核苷酸序列依次如SEQIDNO:1-7所示；所述牛源Adx是编码4到108位氨基酸的核苷酸序列，具体所述电子传递体基因Adx、电子传递体基因AdR核苷酸序列依次如SEQIDNO:8-9所示；上述各基因均适当规避常用限制性酶切位点后通过人工合成得到，在本专利技术具体实施方式中，为了改善转入的大肠杆菌工程菌高效生物转化效率，SEQIDNO:1-9所示核苷酸序列还经过大肠杆菌密码子优化。同时，本专利技术根据所述重组质粒所能实现的技术效果提出了其在将17α-羟孕酮生物转化为21-脱氧皮质醇中的应用和/或在制备将17α-羟孕酮生物转化为21-脱氧皮质醇的工程菌中的应用；作为优选，所述工程菌为大肠杆菌，更优选地为MG1655(DE3)菌株，该菌株是MassachusettsInstituteofTechnology的KristalaL.J.Prather教授文章中发布的菌株(TsengHC,HarwellCL,MartinCH,etal.Biosynthesisofchiral3-hydroxyvaleratefromsinglepropionate-unrelatedcarbonsourcesinmetabolicallyengineeredE.coli[J].Microbialcellfactories,2010,9(1):1)，文中详细记载了将市售MG1655大肠杆菌通过基因工程技术改造为一类能够有效表达异源蛋白的菌株，统一命名为MG1655(DE3)。本专利技术还对应提供了所述重组质粒的构建方法，包括：将11位β羟化酶基因CYP11B1、电子传递体基因Adx、电子传递体基因AdR通过酶切方式连接到包含T7启动子和T7终止子的基础质粒上，所述11位β羟化酶能基因CYP11B1、电子传递体基因Adx、电子传递体基因AdR位于T7启动子和T7终止子之间，获得重组质粒。作为优选，所述构建方法包括：分别在11位β羟化酶基因CYP11B1、电子传递体基因Adx和电子传递体基因AdR5’端添加NdeI酶切位点、3’端添加SpeI酶切位点，然后分别将三个外源基因通过SpeI和NdeI酶切后，连入添加有SpeI酶切位点的pET21a质粒中，得到pET21a-CYP11B1质粒、pET21a-Adx质粒和pET21a-AdR质粒，所述SpeI酶切位点位于NdeI和BamHI酶切位点之间；将pET21a-CYP11B1质粒、pET21a-Adx质粒和pET21a-AdR质粒中任意两个质粒分别进行XbaI和BamHI酶切获得两个目的基因，将两个目的基因逐个与进行SpeI和BamHI酶切的剩余质粒连接，获得重组质粒。在上述构建方法中，本专利技术采用biobrick的构建策略，利用SpeI与XbaI是同尾酶，经过处理后会留下相同的粘性末端的特点，在T4连接酶的作用下将所需要的三个外源基因逐个连接到基础质粒上，并且保证已连接的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组质粒，其特征在于，在基础质粒上包括T7启动子、T7终止子、11位β羟化酶基因CYP11B1、电子传递体基因Adx、电子传递体基因AdR，所述11位β羟化酶能基因CYP11B1、电子传递体基因Adx、电子传递体基因AdR位于T7启动子和T7终止子之间。

【技术特征摘要】
1.一种重组质粒，其特征在于，在基础质粒上包括T7启动子、T7终止子、11位β羟化酶基因CYP11B1、电子传递体基因Adx、电子传递体基因AdR，所述11位β羟化酶能基因CYP11B1、电子传递体基因Adx、电子传递体基因AdR位于T7启动子和T7终止子之间。2.根据权利要求1所述重组质粒，其特征在于，所述基础质粒为pET21a质粒。3.根据权利要求1所述重组质粒，其特征在于，所述11位β羟化酶基因CYP11B1为人源(Homosapiens)、牛源(BosTaurus)、褐家鼠来源(Rattusnorvegicus)，羊源(Ovisaries)、袋獾来源(Sarcophilusharrisii)、狐蝠源(PteropusAlecto)或日本鬼伞科蘑菇来源(Coprinopsiscinereaokayama7#130)的野生型CYP11B1或突变型CYP11B1。4.根据权利要求3所述重组质粒，其特征在于，所述人源、牛源、褐家鼠来源，羊源、袋獾来源、狐蝠源以及日本鬼伞科蘑菇来源的突变型CYP11B1核苷酸序列依次如SEQIDNO:1-7所示。5.根据权利要求1所述重组质粒，其特征在于，所述电子传递体基因Adx、电子传递体基因AdR均为牛源(BosTaurus)基因。6.根据权利要求5所述重组质粒，其特征在于，所述电子传递体基因Adx、电子传递体基因AdR核苷酸序列依次如SEQIDNO:8-9所示。7.权利要求1-6任意一项所述重组质粒在将17α-羟孕酮生物转化为21-脱氧皮质醇中的应用和/或在制备将17α-羟孕酮生物转化为21-脱氧皮质醇的工程菌中的应用。8.根据权利要求7所述应用，其特征在于，所述工程菌为大肠杆菌。9.根据权利要求8所述应用，其特征在于，所述大肠杆菌为MG1655(DE3)菌株。10.权利要求1所述重组质粒的构建方法，其特征在于，包括：将11位β羟化酶基因CYP11B1、电子传递体基因Adx、电子传递体基因AdR通过酶切方式连接到包含T7启动子和T7终止子的基础质粒上，所述11位β羟化酶能基因CYP11B1、电子传递体基因Adx、电子传递体基因AdR位于T7启动子和T7终止子之间，获得重组质粒。11.根据权利要求10所述构建方法，其特征在于，包括：分别在11位β羟化酶基因CYP11B1、电子传递体基因Adx和电子传递体基因AdR5’端添加NdeI酶切位点、3’端添加SpeI酶切位点，然后分别将三个外源基因通过SpeI和NdeI酶切后，连入添加有SpeI酶切位点的pET21a质粒中，得到pET21a-CYP11B1质粒、pET21a-Adx质粒和pET21a-AdR质粒，所述SpeI酶切位点位于NdeI和BamHI酶切位点之间；将pET21a-CYP11B1质粒、pET21a-Adx质粒和pET21a-AdR质粒中任意两个质粒分别进行XbaI和BamHI酶切获得两个目的基因，将两个目的基因逐个与进行SpeI和BamHI酶切的剩余质粒连接，获得重组质粒。12.根据权利要求11所述构建方法，其特征在于，包括：分别在11位β羟化酶基因CYP11B1、电子传递体基因Adx和电子传递体基因AdR5’端添加核苷酸序列CAT、3’端添加核苷酸序列CTAGT，然后分别将三个外源基因通过SpeI和NdeI酶切后，连入添加有SpeI酶切位点的pET21a质粒中，得到pET...

【专利技术属性】
技术研发人员：李霞，熊淑婷，肖文海，王颖，刘宏，元英进，
申请(专利权)人：天津大学，
类型：发明
国别省市：天津;12