防治当归早薹的药物及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种防治当归早薹的药物，本发明专利技术通过反转录双链DNA扩增片段长度多态性分析技术研究早薹当归和正常当归在基因转录水平的差异，研究结果表明早薹当归中促进多胺类植物生长调节剂合成的基因表达活性显著升高，多胺类植物生长调节剂可能促进当归早薹的发生。本发明专利技术利用当归多胺类植物生长调节剂合成抑制剂(α-二氟甲基鸟氨酸)防治当归早薹。实验结果表明：采用α-二氟甲基鸟氨酸，可以有效的防治当归早薹，两次施药，高剂量的α-二氟甲基鸟氨酸抑制当归早薹50％以上。α-二氟甲基鸟氨酸可制备成绿色环保、高效、低毒的防治当归早薹的农药，可提高当归产量和品质，具有重要的环境保护意义和经济价值，值得推广和应用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种药物及其参与形成的复方药物，具体涉及防治当归早薹的药物及其应用。
技术介绍
当归早薹影响当归的产量和品质，当归早薹与其它同类植物发生早薹的生理基础是一致的，即低温通过春化阶段、长日照、激素以及自主途径促进发育，进而抽薹开花，目前防治当归早薹还没有切实可行的方法。进一步深入研究当归早薹发展进程与环境条件的关系，研究其内部营养物质和激素的生理生化变化规律，阐明当归早薹发生的分子调控机制，是解决当归早薹问题切实可行的方法。cDNA-AFLP是从AFLP衍生而来的RNA指纹识别技术，现已发展成较为成熟的转录组研究技术，运用该技术可从转录水平鉴定mRNA差异，从而阐明基因调控在RNA水平的表现，可对生物体转录组进行全面、系统的分析。当转录产物高度表达时，扩增条带的强度高低甚至能直接反应出基因表达量的差别，并且获得的转录衍生片段(tnarscript-derivedfragments,TDFs)一般也集中在蛋白的编码区或者附近，可最大限度的提供基因编码区的信息。cDNA-AFLP自身的优点使其成为最有效的分离差异表达基因的方法之一。利用cDNA-AFLP可以方便的将不同的生理发育阶段或不同组织的差异表达基因分离出来。本专利通过以上技术研究早薹当归和正常当归在基因表达水平的差异，揭示当归早薹的分子机制，对研究结果的进一步分析发现当归早薹性状和多胺类植物生长调节剂的合成相关，因此本专利选择相关的抑制剂抑制多胺类植物生长调节剂的合成以达到防治当归早薹的目的。
技术实现思路
专利技术目的：本专利技术的目的是为了解决现有技术的不足，通过当归早薹的分子机制的实验研究发现多胺类植物生长调节剂对当归早薹的发生具有重要作用，通过抑制多胺类植物生长调节剂合成可达到防治当归早薹的目的，在此基础上本专利技术提供一种当归多胺类植物生长调节剂合成的抑制剂。技术方案：为了实现以上目的，本专利技术采取的技术方案为，一种防治当归早薹的药物，它为当归多胺类植物生长调节剂合成的抑制剂。作为优选方案，以上所述的防治当归早薹的药物，它为S-腺苷甲硫氨酸合成酶的抑制剂。作为优选方案，以上所述的防治当归早薹的药物，所述的抑制剂为α-二氟甲基鸟氨酸。α-二氟甲基鸟氨酸在制备防治当归早薹农药制剂中的应用。一种防治当归早薹的农药制剂，它由α-二氟甲基鸟氨酸和助剂制成乳油、悬浮剂、粉剂、粒剂、水剂农业制剂。cDNA-AFLP是研究样本之间基因表达差异的有效方法，本专利技术采用cDNA-AFLP技术研究早薹当归在基因表达水平和正常当归的差异，通过大量实验研究当归早薹的分子机制，构建当归早薹的分子调控网络，并在此基础提出抑制针对影响当归多胺类植物生长调节剂合成的早薹防治途径。抑制当归早薹药物筛选：1.RNA的提取与鉴定采集早薹当归和正常当归的样品立刻在液氮中冷冻，后置于-80℃冷冻保存。采用Trizol(Invitrogen公司产品)分离当归样品总RNA，用DEPC水溶解，然后用1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量。2.反转录双链cDNA的合成以所提取总RNA中的mRNA为模板，按照PromegaUniversalRiboclonecDNASynthesisSystem试剂盒(C4360)提供的方法合成双链cDNA，最后溶于DEPC水中。3.cDNA-AFLP方法的建立(1)酶切反应合成的双链cDNA用EcoRⅠ和MseⅠ(上海生工生物工程技术服务有限公司)双酶切，37℃过夜，65℃2h。(2)连接反应酶切产物在连接酶的催化下和接头4℃过夜。EcoRI接头：5’-CTCGTAGACTGCGTACC-3’，5’-AATTGGTAGCAGTC-3’；MseI接头：5’-GACGATGAGTCCTGAG-3’，5’-TACTCAGGACTCAT-3’。反应体系：酶切产物5μL，Buffer1μL，MseⅠ接头(50μΜ)0.5μL，EcorⅠ接头(5μM)0.5μL，加ddH2O至总体积10μL。(3)连接产物预扩增EcoRⅠ预扩增引物E00：5’-GACTGCGTACCAATTC-3’；MseⅠ预扩增引物M00：5’-GATGAGTCCTGAGT-3’。预扩增条件：94℃变性3min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min(26个循环)；72℃延伸5min。(4)预扩增产物选择性扩增选择性扩增设立模板浓度梯度、酶离子浓度梯度、dNTP浓度梯度。扩增结果电泳检测，优化选择性扩增反应体系。EcoRⅠ选择性扩增引物：5’-GACTGCGTACCAATTCNN-3’(N代表ATCG中任意一种)；MseⅠ选择性扩增引物5’-GATGAGTCCTGAGTNN-3’(N代表ATCG中任意一种)。选择性扩增条件：94℃变性3min；94℃变性30s，65℃退火30s(每次循环下降0.7℃)，72℃延伸1min(13个循环)；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min(24个循环)；72℃延伸5min。4.聚丙烯酰胺凝胶电泳分析按照优化的反应条件进行选择项扩增，选择性扩增引物，选择性扩增产物在6％的变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳，电泳结果硝酸银染色。5.差异表达片段的分离和再扩增(1)差异表达片段的分离染色后的聚丙烯酰胺凝胶比较早薹和正常当归基因表达差异，割取表达活性差异明显、分子量较大的片段。50μLddH2O溶解，95℃加热15min，4℃过夜，-20℃冷冻保存。(2)差异表达片段的PCR扩增2μL差异表达片段溶解液作为反应模板再次通过PCR反应对差异表达基因进行富集。扩增引物和选择性扩增引物一致。反应条件94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min(30个循环)；72℃延伸5min。扩增产物用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测。将电泳条带从琼脂糖凝胶上割取，Takara割胶纯化试剂盒对割取的凝胶进行分离纯化。6.割胶纯化产物的克隆和测序(1)连接反应(2)感受态细胞的制备(3)连接产物的转化热激法将连接产物转化入E.coliDH5α感受态细胞。(4)重组质粒的筛选与鉴定①重组质粒的筛选取200μL已转化的感受态细胞悬液涂布于含有75μg/mLAMP的LB平板，待液体被完全吸收后，37℃倒置培养16-18h，挑取克隆。②重组质粒的提取③重组质粒的PCR鉴定用PCR方法鉴定所提质粒是否含有外源目的片段。7.测序送上海生物工程技术服务公司用通用引物测本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种防治当归早薹的药物，其特征在于，它为当归多胺类植物生长调节剂合成抑制剂。

【技术特征摘要】
1.一种防治当归早薹的药物，其特征在于，它为当归多胺类植物生长调节剂合成抑制剂。
2.根据权利要求1所述的防治当归早薹的药物，其特征在于，它为S-腺苷甲硫氨酸合成
酶的抑制剂。
3.根据权利要求1或2所述的防治当归早薹的药物，其特征在于，所述的抑制剂为α...

【专利技术属性】
技术研发人员：段金廒，于光，严辉，
申请(专利权)人：南京中医药大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32