本发明专利技术提供针对乙肝病毒基因的２条ｓｉＲＮＡ的ｃＤＮＡ靶序列，ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１为ａｎｔｉ－ｓ ｓｉＲＮＡ１的核苷酸序列，ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２为ａｎｔｉ－ｓ ｓｉＲＮＡ２的核苷酸序列。这２条ｓｉＲＮＡ分别和报告质粒ｐＧＦＰ－Ｓ共转染ＨｅｐＧ２细胞后，可抑制报告基因绿荧光蛋白的表达；这２条ｓｉＲＮＡ转染ＨｅｐＧ２．２．１５细胞后，可有效抑制ＨＢｓＡｇ的表达。因此，针对ＨＢＶ（ａｙｗ亚型）Ｓ基因的２条ｓｉＲＮＡ，可抑制ＨＢｓＡｇ的表达，可在制备ＨＢＶ慢性感染的治疗药物中应用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物技术，涉及基因工程
和生物信息学领域，具体地涉及针对乙肝病毒(HBV)基因的siRNA靶序列的设计、合成及其在体内外抑制HBV的应用。
技术介绍
RNA干扰(RNA interference，RNAi)现象的发现，被《SCIENCE》杂志和美国科学促进会评为2002年十大科学成就之一。RNA干扰是指同源双链RNA的导入引起目标基因的不表达或减效表达，在哺乳动物细胞中，21-23个核苷酸长度的双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)，可有效降解同源RNA，从而阻断蛋白质的表达，这些特定长度的dsRNA被称为siRNA(small interferingRNAs)。RNA干扰被称为RNA基础上的细胞“免疫”系统。经证实RNA干扰技术具有以下特点(1)特异性高一个碱基的不同就可导致作用的显著降低；(2)高效少量siRNA分子就能较彻底抑制细胞内相应基因的表达；(3)稳定由于RNA干扰采用的是双链RNA，它比较稳定，不易被降解，因此RNA干扰不仅在体外，而且在动物体内亦具有较好的效果；(4)筛选周期短针对某一基因的有效siRNA序列筛选的方法较简单，因此研发周期较短。RNAi在HIV的体外实验中取得了较理想的结果。Rossi等将HIV-1编码rev的基因和与它同源的双链RNA共转染293细胞，rev基因的表达被显著抑制；同时将siRNA的抑制效应与反义RNA和核酶等进行了比较，发现只有siRNA组抑制了HIV rev-EGFP的表达，其抑制率达到90％，远优于反义RNA和核酶组，这一结果同样被Novina等学者所证实。Novina等用针对CD4的dsRNA能将细胞表面HIV病毒的受体表达减少75％，从而抵抗HIV病毒的感染。因此，针对病毒基因的siRNA是慢性病毒性感染的最佳治疗策略，具有广阔的应用前景。慢性乙型肝炎是我国的高发疾病之一，是导致肝纤维化和肝癌的主要原因。目前治疗乙型肝炎的药物主要是以α干扰素为主的免疫调节剂和以拉米呋啶、阿德福韦为主的核苷类似物，但治疗效果仍不满意。HBV DNA的持续复制是导致乙型肝炎慢性化的主要原因。因此有效抑制HBV DNA复制，是治疗慢性乙型肝炎和控制HBV持续感染的关键。HBV DNA的复制是一个DNA-RNA-DNA的过程，其中前基因组RNA含有病毒DNA上全部遗传信息，是子代病毒前基因组反转录的模板。如果能够特异性阻断HBV前基因组RNA的逆转录及3.5kb，2.4kb，2.1kb和0.9Kb四种未剪切mRNA的翻译表达，将有效抑制HBVcccDNA在肝细胞中的再生成和子病毒的产生。因为HBV前基因组RNA的逆转录及未剪切mRNA的翻译过程均发生在细胞浆，容易受到针对靶序列的siRNAs的攻击而特异性地降解，所以本专利利用RNA干扰技术特异性降解HBV RNAs，达到抗HBV的作用。
技术实现思路
本专利技术的目的是根据siRNA的设计原理，提供针对HBV(ayw亚型)S基因的siRNA的cDNA靶序列。根据cDNA靶序列，化学合成法合成siRNA。这2条siRNA分别和报告质粒pGFP-S共转染HepG2细胞后，可抑制报告基因绿荧光蛋白的表达；这2条siRNA转染HepG2.2.15细胞后，可有效抑制HBsAg的表达。因此，针对HBV(ayw亚型)S基因的siRNA，可抑制HBsAg的表达，可在制备治疗HBV慢性感染的药物中应用。本专利技术提供针对HBV(ayw亚型)S基因的2条siRNA的目标cDNA靶序列为SEQ ID NO.1(anti-s siRNA1)5’-AAACCTTCGGACGGAAATTGC-3’SEQ ID NO.2(anti-s siRNA2)5’-AATACCGCAGAGTCTAGACTC-3’具体实施方式本专利技术结合实施例作进一步说明。实施例一 合成干扰RNA体外抑制HBV表面抗原融合基因的表达1.siRNA的设计 根据siRNA的设计原理，从转录本AUG起始密码子开始，搜寻HBV ayw亚型的S基因中的AA序列，记录跟每个AA 3’端相邻的19nt作为候选的siRNA靶位点，选择GC含量在40-55％的siRNA序列，通过Genebank的数据库的Blast分析，将潜在的序列和相应的人基因组数据库进行比较，排除那些和其他编码序列/EST同源的序列，设计针对HBV(ayw亚型)S基因的2条siRNA的目标cDNA靶序列。序列如下(anti-s siRNA1)5’-AAACCTTCGGACGGAAATTGC-3’(anti-s siRNA2)5’-AATACCGCAGAGTCTAGACTC-3’ 2.siRNA的化学合成和双链退火 根据siRNA设计原则，分别合成anti-ssiRNA1和anti-s siRNA2的正义链和反义链如下。每条链的5’端为磷酸盐，3’端羟基化，有两个碱基外悬，通过化学合成而得。形成双链siRNA的退火处理正义链和反义链各20μM，加入退火缓冲液(100μM KAc，30mM HEPES-KOH，pH7.4，2mM MgAc2)，90℃水浴1min，37℃水浴1h。anti-s siRNA15’-ACCUUCGGACGGAAAUUGCdTdT-3’(sense siRNA)5’-GCAAUUUCCGUCCGAAGGUdTdT-3’(antisense siRNA)anti-s siRNA25’-UACCGCAGAGUCUAGACUCdTdT-3’(sense siRNA)5’-GAGUCUAGACUCUGCGGUAdTdT-3’(antisense siRNA)3.anti-s siRNA抑制报告质粒pGFP-S和siRNA共转染HepG2细胞的绿荧光蛋白表达和HBV S基因表达的实验(1)报告质粒pGFP-S和siRNA共转染HepG2细胞 报告质粒pGFP-S是表达报告基因绿荧光蛋白和HBsAg融合蛋白的质粒。HepG2细胞按照1×105/孔接种24孔板，培养24小时后达到80％-90％融合率，共转染pGFP-S和siRNA，具体步骤参照Invitrogen公司Lipofectamine2000说明书。6小时后换10％FCS DMEM，同时设置只转染pGFP-S载体的阴性组，每组重复3孔。(2)荧光显微镜观察细胞绿荧光蛋白表达 转染48小时后，在倒置荧光显微镜(DM IRB，Leica)下观察绿荧光蛋白在HepG2细胞中的表达情况。结果显示，与pGFP-S载体的阴性组相比，转染pGFP-S和anti-S siRNA的HepG2细胞的荧光强度减弱，荧光细胞数减少。(3)流式细胞仪观察细胞绿荧光蛋白表达 转染48小时后，常规消化HepG2细胞，离心悬液，重悬于PBS，流式细胞仪检测表达荧光蛋白的阳性细胞数比例和平均荧光强度。结果显示，与pGFP-S载体的阴性组相比，转染pGFP-S和siRNA的HepG2的阳性细胞数比例降低，平均荧光强度降低。(4)逆转录-实时荧光定量PCR法检测HBV S基因RNA的表达RNA准备转染72小时后，收获HepG2细胞，Trizol法抽提RNA，方法参照Invitrogen公司说明书。逆转录，过程参照MBI操作说明书。本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种乙肝病毒基因的ａｙｗ亚型Ｓ基因的ｓｉＲＮＡ的ｃＤＮＡ靶序列，其核苷酸序列为：ＡＡＴＡＣＣＧＣＡＧＡＧＴＣＴＡＧＡＣＴＣ。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：陈智，羊正纲，朱海红，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：86[中国|杭州]
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