本发明专利技术属于分子生物学、临床预后判断领域，涉及CPT1A基因或蛋白的定量检测在食管鳞癌预后判断中的应用。具体地，本发明专利技术涉及CPT1A基因或蛋白的定量检测试剂在制备食管鳞癌预后判断试剂盒中的用途，用于食管鳞癌预后判断的试剂盒，以及检测食管鳞癌患者CPT1A基因拷贝数或蛋白表达水平的方法。当CPT1A基因的拷贝数增加或蛋白过表达时，提示食管鳞癌患者术后生存期短。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子生物学、临床预后判断领域，具体涉及CPTlA基因的拷贝数或蛋白表达水平在食管鳞癌预后判断中的应用。本专利技术还涉及CPTlA基因拷贝数和蛋白表达水平的检测方法。
技术介绍
食管鳞状细胞癌简称食管鳞癌，是人类常见的消化道恶性肿瘤之一。食管组织细胞在ー些生物、物理、化学及其他因素刺激下异常增生直至癌变为食管鳞癌的病理特点，进行性吞咽困难是其主要临床表现。食管鳞癌的发病机制目前尚不清楚。全球毎年新增病例超过45万，死亡病例超过38万。值得注意的是，中国依然是食管鳞癌的高发地区。2006年全国第三次死因回顾抽样人口调查资料显示中国食管鳞癌高发县标准化死亡率在10. 34/10万-78. 32/10万之间，占全部恶性肿瘤死亡的11. 69% -42. 61%。男女年龄调整死亡率合计为15. 78/10万，均居恶性肿瘤死亡顺位的第四位。特别是在多数农村高发区，食管鳞癌的发生率和死亡率多年来一直居高不下，是ー项严重的社会问题。食管癌预后很差，长期存活率低于5%。复发和远处转移是术后治疗失败的主要原因。目前临床实践中，病理分期是最重要、最可靠的预后指标，但是仍然需要更精确的标志物进ー步将术后病人划分为高风险和低风险，进而采取更有效的治疗。食管鳞癌的基因组改变中包含了许多可以用于早期诊断、预后判断和药物靶点的信息，因此许多的研究致カ于从基因组改变中寻找食管鳞癌的预后分子标志物。目前的研究发现，ー些染色体区域的基因组改变与预后有夫。Ueno等通过比较基因组杂交技术发现5pl5,8q24-qter和14q21的増益与食管鳞癌的不良预后显著相关，多因素分析进ー步显示5pl5是ー个独立的预后因子。另ー项研究结果显示病理分期、12p的増益和3p的缺失与短的无进展生存期相关，其中12p是独立于病理分期的预后因素(Kwong D et al. 2004)。Carneiro课题组利用比较基因组杂交芯片技术筛选与食管鳞癌预后相关的基因组改变，结果表明1ρ36.32和19pl3. 3的增益是独立的预测食管鳞癌术后生存的因素。另ー项比较基因组杂交芯片的工作发现4q、13q、20q和Xq的拷贝数改变与预后相关(Hirasaki etal. 2007)。尽管已发现了上述与食管鳞癌预后相关的DNA分子标志物，但是均未能应用于临床检测。CPTlA和CPTlB是肉碱棕榈酰转移酶I。CPTl定位于线粒体外膜，是细胞内脂肪 代谢的调控位点，并且具有将长链脂肪酸转运入线粒体进行beta-氧化的功能。研究表明，CPTl可以与BCL2相互作用，而后者具有调节细胞凋亡的功能
技术实现思路
在此背景下，本专利技术系统研究了食管鳞癌中与预后相关的基因组改变，发现CPTlA所在的llql3. 2区域的増益具有预后判断价值，进而在两个独立样本中验证该基因的増益与预后的关系，同时也发现CPTlA基因(Gene ID 1374)的拷贝数増加或蛋白的强表达与食管鳞癌不良预后相关。本专利技术的第一方面涉及CPTlA基因或蛋白的定量检测试剂在制备食管鳞癌预后判断试剂盒中的用途。根据本专利技术第一方面的用途，其中所述的CPTlA基因的定量检测的方法为本领域常用的核酸定量检测方法，例如可以为电泳法或定量PCR法。在本专利技术的一个实施方案，所述的CPTlA基因的定量检测方法为实时荧光定量PCR的方法。根据本专利技术第一方面的用途，其中所述的CPTlA蛋白定量检测的方法为本领域常用的蛋白定量检测方法，例如可以为电泳法、色谱法或免疫组织化学的方法。在本专利技术的一个实施方案，所述的CPTlA蛋白的定量检测方法为免疫组织化学法。 根据本专利技术第一方面的用途，其中所述的CPTlA基因或蛋白的定量检测方法中包括使用定量检测试剂的步骤。根据本专利技术第一方面的用途，其中所述的CPTlA基因的定量检测试剂包括用于定量检测CPTlA基因的寡核苷酸片段；任选地，还包括用于定量检测GAPDH的寡核苷酸片段；任选地，还包括检测缓冲液。根据本专利技术第一方面任ー项的用途，其中所述的寡核苷酸片段为引物或探针。在本专利技术的一个实施方案中，所述的寡核苷酸片段为引物。在本专利技术的一个实施方案中，其中用于定量检测CPTlA基因的引物序列为SEQ IDNO 1和2所示序列；在本专利技术的一个实施方案中，其中用于定量检测GAPDH的引物序列为SEQ ID NO :3和4所示序列。根据本专利技术第一方面的用途，其中所述的CPTlA蛋白的定量检测试剂包括与CPTlA蛋白特异性结合的抗体，所述抗体为多克隆抗体或单克隆抗体；任选地，还包括检测缓冲液。在本专利技术的一个实施方案中，其中所述的抗体为抗CPTlA的多克隆抗体，购于Proteintech 公司，其货号为 15184-1-AP。根据本专利技术第一方面的用途，其中所述的食管鳞癌预后判断方法为=CPTlA基因的拷贝数増加，则食管鳞癌患者术后生存期短；或者，CPTlA蛋白过表达，则食管鳞癌患者术后生存期短。在本专利技术的实施方案中，所述的CPTlA基因拷贝数可以利用实时定量PCR的方法測量得到；所述方法中包括使用扩增CPTlA基因的引物的步骤，以及使用扩增GAPDH基因的引物的步骤；測定结果采用2_“ct的方法进行分析。所述的实时定量PCR方法具体包括以下步骤配制体积为20 μ I的反应体系,包括10 μ I 2 XPower SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems)，2 μ I 样品 DNA (5ng/μ 1)，1μ I引物混合液(10 μ M/每条引物)和7μ I去离子水；在7300或7900Real_TimePCR System (Applied Biosystems)上,进行如下程序先进行95°C IOmin的热变性,然后进行40个循环，每个循环包括95°C 15sec和60°C Imin的程序。结果采用2_Λ ct的方法进行分析。所述的拷贝数增加是指，2_ΛΛα> I. 25，其中Λ ACt= Δ Ct (待测样本)-Λ Ct (内參照)。其中所述的内參照为GAPDH。在本专利技术的实施方案中，所述的CPTlA蛋白表达水平可以利用免疫组织化学方法測量得到；所述的免疫组织化学方法中包括使用抗CPTlA多克隆抗体的步骤；在本专利技术的一个实施方案中，所述抗CPTlA多克隆抗体购于Proteintech公司，其货号为15184-1-ΑΡ。所述的蛋白过表达是指在随机观察的3个视野中，强表达细胞所占比例平均值高于 50%。所述强表达细胞是指与阴性着色细胞相比有明显着色的细胞，其中阴性着色细胞指目标蛋白不表达，不着色的细胞。在本专利技术的一个实施方案中，所述的免疫组织化学方法具体包 括以下步骤先将组织切片在65°C烘箱中烘烤30min，然后ニ甲苯脱蜡3次，每次lOmin，接着梯度こ醇水化(100%，85%，75% )，每次3min，然后置于IXPBS中洗涤2次，每次5min，用3%的过氧化氢处理IOmin后，接着用枸櫞酸钠溶液修复抗原20min，经I XPBS洗涤后，加入抗CPTlA抗体，4°C过夜孵育，经I XPBS洗涤后，用pv9000试剂盒处理后，加DAB显色，苏木素复染，经梯度こ醇脱水(75%，85%，100% )和ニ甲苯透明后，封片和镜检。本专利技术的第二方面涉本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
2011.03.09 CN 201110054980.X1.CPTlA基因或蛋白的定量检测试剂在制备食管鳞癌预后判断试剂盒中的用途。2.权利要求I的用途，其中所述的CPTlA基因的定量检测的方法为实时荧光定量PCR方法；其中所述的CPTlA蛋白的定量检测的方法为免疫组织化学方法。3.权利要求I或2的用途，其中所述的CPTlA基因的定量检测试剂包括用于定量检测CPTlA基因的寡核苷酸片段，例如为引物或探针；任选地，还包括用于定量检测GAPDH的寡核苷酸片段，例如为引物或探针；任选地，还包括检测缓冲液。4.权利要求3的用途，其中用于定量检测CPTlA基因的引物序列为SEQID NO :1和SEQID NO 2所示序列；和/或用于定量检测GAPDH的引物序列为SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 4所示序列。5.权利要求I或2的用途，其中所述的CPTlA蛋白的定量检测试剂包括与CPTlA蛋白特异性结合的抗体...
【专利技术属性】
技术研发人员：王明荣，史志周，徐昕，郝佳洁，
申请(专利权)人：中国医学科学院肿瘤研究所，
类型：发明
国别省市：
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