本发明专利技术公开了一种培养NK和/或NKT细胞的方法。本发明专利技术提供了一种培养NK和/或NKT细胞的方法，包括如下步骤：将离体的NK和/或NKT细胞接种到如下培养体系A中培养，即得到增殖的NK和/或NKT细胞；所述培养体系A由含有抗CD3抗体和/或Retronectin的缓冲液和诱导因子组成。本发明专利技术的实验证明，将提取自外周血的PBMC经过磁珠分离富集后，获得高纯度的CD56+细胞，在体外培养体系中加入Retronectin和CD3mAb两种蛋白共同刺激，同时辅以IL-2和IL-15两种因子诱导，建立一个可获得大量具有高杀伤活力的NK和NKT细胞的培养方法。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种NK和/或NKT细胞的培养方法。
技术介绍
NK细胞，是骨髓来源的淋巴细胞，可以识别并杀死病毒感染的细胞或转化的恶性细胞。NK细胞是体内快速反应细胞，能迅速被募集至损伤部位，在体外I小时、体内4小时即可见到杀伤效应。NK细胞的功能是其他免疫细胞无法替代的，其杀伤肿瘤细胞的效应无MHC限制，因此称为自然杀伤活性；而且，NK细胞通过分泌IFN-gamma以及与DC相互作用促进Thl型T细胞活化。体外培养的NK细胞包括⑶56弱表达和⑶56强表达伴随⑶16表达或不表达细胞群。CD56强表达细胞群通过非MHC限制途径杀伤肿瘤细胞；而CD56弱表达且⑶16+细胞群则通过⑶16-Fc途径直接产生ADCC，且肿瘤相关抗原的刺激能进一步促进ADCC。鉴于NK细胞在抗肿瘤免疫中的重要功能，有必要开发一种有效的体外培养并大量扩增具有肿瘤杀伤活性的NK细胞的方法。 现有的NK细胞体外培养方法尽管已比较成熟，能够培养出对肿瘤细胞杀伤性很高的NK细胞，但增殖数量还不够满意。IL-2、IL-15和IL-7可以通过与NK细胞表面的多聚蛋白体受体的结合而刺激细胞活化、增殖。此外，一些研究还发现这三种细胞因子与NK细胞的分化相关。然而，在培养基中仅添加IL-2、IL-15只能使NK细胞扩增10倍左右，并且通常需要饲养层细胞共同培养，操作复杂，细胞得率低。RetroNecinn是TAKARA Bio Inc的专利产品，属于重组人纤维连接蛋白片段，它含有人纤维连接蛋白CS-I位点和central cell-binding domain,分子量约为63K,其生理活性为参与细胞的附着、伸展、分化和增殖。RetroNectin的CS-Isite及centralcell-binding domain可与T细胞表面的VLA结合,从而刺激细胞大量繁殖。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种培养NK和/或NKT细胞的方法。本专利技术提供的方法，包括如下步骤将离体的NK和/或NKT细胞接种到如下培养体系A中培养，即得到增殖的NK和/或NKT细胞；所述培养体系A为如下I)或2):I)所示培养体系A由抗⑶3抗体、Retronectin、培养基和诱导因子组成；2)所示培养体系A由抗⑶3抗体、培养基和诱导因子组成。所述抗⑶3抗体与所述培养基的配比为5 μ g 5ml;所述Retronectin与所述培养基的配比为25 μ g : 5ml;所述诱导因子为IL-2和IL-15 ；所述IL-2在所述培养体系A中的浓度为800-1200IU/ml，所述IL-2在所述培养体系A中的浓度具体为1000IU/ml ；所述IL-15在所述培养体系A中的浓度为18ng/ml-22ng/ml,所述IL-15在所述培养体系A中的浓度具体为20ng/ml。I)所示培养体系A中的所述抗⑶3抗体和Retronectin由缓冲液A提供每2ml所述缓冲液A按照如下方法制备将25 μ g Retronectin、5 μ g抗⑶3抗体和浓度为O. 01M、PH值为7. 2的PBS缓冲液混合，用所述PBS缓冲液补至2ml ；2)所示培养体系B中的所述抗⑶3抗体由缓冲液B提供每2ml所述缓冲液B按照如下方法制备将25 μ g Retronectin和浓度为O. 01M、PH值为7. 2的PBS缓冲液混合，用所述PBS缓冲液补至2ml ；所述培养时间为70小时-74小时，所述培养时间具体为72小时，所述培养温度为350C -38°C，所述培养温度具体为37°C，所述培养所需CO2的浓度为4. 5% -5. 5% (体积百分含量)，所述培养所需CO2的浓度具体为5% (体积百分含量)。 在所述培养步骤后，还包括如下步骤将所述培养得到的细胞移入不含有抗⑶3抗体和Retronectin的培养体系B中继续培养，得到增殖的NK和/或NKT细胞；所述培养体系B和所述培养体系A的区别为不含有抗⑶3抗体和Retronectin，其它组分和各组分浓度均相同。所述缓冲液A、所述缓冲液B和所述诱导因子均为独立包装。所述培养基为10% (体积百分含量)离体血浆的T503培养基，即为10% (体积百分含量)自体血浆的T503培养基；所述抗⑶3抗体为单抗或者多抗；所述抗⑶3抗体具体为Anti-⑶3 (单抗)。所述离体的血浆与所述离体的NK和/或NKT细胞来源于同一物种；所述物种具体为人或动物；所述离体的血浆与所述离体的NK和/或NKT细胞来源于同一个体。本专利技术的另一个目的是提供一种用于培养NK和/或NKT细胞的培养体系。本专利技术提供的用于培养NK和/或NKT细胞的培养体系，所述培养体系A为如下I)或2)I)所示培养体系A由抗⑶3抗体、Retronectin、培养基和诱导因子组成；2)所示培养体系A由抗⑶3抗体、培养基和诱导因子组成。所述抗⑶3抗体与所述培养基的配比为5 μ g : 5ml;所述Retronectin与所述培养基的配比为25 μ g : 5ml;所述诱导因子为IL-2和IL-15 ;所述IL-2在所述培养体系A中的浓度为800_1200IU/ml，所述IL-2在所述培养体系A中的浓度具体为1000IU/ml ；所述IL-15在所述培养体系A中的浓度为18ng/ml_22ng/ml，所述IL-15在所述培养体系A中的浓度具体为20ng/ml。I)所示培养体系A中的所述抗⑶3抗体和Retronectin由缓冲液A提供每2ml所述缓冲液A按照如下方法制备将25 μ g Retronectin、5 μ g抗⑶3抗体和浓度为0. 01M、PH值为7. 2的PBS缓冲液混合，用所述PBS缓冲液补至2ml ；2)所示培养体系B中的所述抗⑶3抗体由缓冲液B提供每2ml所述缓冲液B按照如下方法制备将25 μ g Retronectin和浓度为O. 01M、PH值为7. 2的PBS缓冲液混合，用所述PBS缓冲液补至2ml ；所述培养基为含10% (体积百分含量)离体血浆的T503培养基；所述抗⑶3抗体为单抗或者多抗；所述抗CD3抗体具体为Anti_CD3。所述缓冲液A、所述缓冲液B和所述诱导因子均为独立包装。所述抗⑶3抗体具体为Anti-⑶3。Anti-⑶3为抗⑶3抗体，为单克隆抗体，购自宝日医生物技术(北京)有限公司进口产品，原产地古巴分子免疫学中心，商品名爱欧山，进口药品注册证号S20030084。 所述离体的血浆与所述离体的NK和/或NKT细胞来源于同一物种；所述物种具体为人或动物；所述离体的血浆与所述离体的NK和/或NKT细胞来源于同一个体。本专利技术的实验证明，本专利技术的方法中，将RetroNectin引入NK细胞的培养体系，利用NK和NKT细胞同样表达VLA的特点，通过Retronectin的刺激达到细胞大量增殖的效果，⑶3mAb可通过与T细胞表面的TCR结合刺激细胞增殖，由于NKT细胞表面也表达TCR分子，因此在培养体系中，还加入了⑶3mAb刺激细胞增殖。Retronectin和⑶3mAb还可以共同作用激活酪氨酸激酶PP125FAK，通过Ras途径刺激细胞的增殖和分化。因此，将提取自外周血的PBMC经过磁珠分离富集后，获得高纯度的CD56+细胞，在体外培养体系中加入Retronect本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
2011.03.17 CN 201110064615.71.一种培养NK和/或NKT细胞的方法，包括如下步骤 将离体的NK和/或NKT细胞接种到如下培养体系A中，培养，即得到增殖的NK和/或NKT细胞； 所述培养体系A为如下I)或2): 1)所示培养体系A由抗CD3抗体、Retronectin、培养基和诱导因子组成； 2)所示培养体系A由抗CD3抗体、培养基和诱导因子组成。2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于 所述抗⑶3抗体与所述培养基的配比为5 ii g 5ml; 所述Retronectin与所述培养基的配比为25 y g : 5ml ； 所述诱导因子为IL-2和IL-15 ； 所述IL-2在所述培养体系A中的浓度为800-1200IU/ml，所述IL-2在所述培养体系A中的浓度具体为1000IU/ml ； 所述IL-15在所述培养体系A中的浓度为18ng/ml-22ng/ml，所述IL-15在所述培养体系A中的浓度具体为20ng/ml。3.根据权利要求I或2所述的方法，其特征在于 1)所示培养体系A中的所述抗CD3抗体和Retronectin由缓冲液A提供 每2ml所述缓冲液A按照如下方法制备将25iig Retronectin、5ii g抗⑶3抗体和浓度为0. 01M、PH值为7. 2的PBS缓冲液混合，用所述PBS缓冲液补至2ml ； 2)所示培养体系B中的所述抗CD3抗体由缓冲液B提供 每2ml所述缓冲液B按照如下方法制备将25iig Retronectin和浓度为0.01M、PH值为7. 2的PBS缓冲液混合，用所述PBS缓冲液补至2ml ； 所述培养时间为70小时-74小时，所述培养时间具体为72小时，所述培养温度为350C -38°C，所述培养温度具体为37°C，所述培养所需CO2的浓度为4. 5% -5. 5% (体积百分含量)，所述培养所需CO2的浓度具体为5% (体积百分含量)。4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于 在所述培养步骤后，还包括如下步骤 将所述培养得到的细胞移入不含有抗CD3抗体和Retronectin的培养体系B中继续培养，得到增殖的NK和/或NKT细胞； 所述培养体系B和所述培养体系A的区别为不含有抗⑶3抗体和R...
【专利技术属性】
技术研发人员：马洁，赵晨，赵平，
申请(专利权)人：中国医学科学院肿瘤研究所，
类型：发明
国别省市：
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