一种海洋软体动物原代细胞分离与培养试剂盒及其用途制造技术

一种海洋软体动物原代细胞分离与培养试剂盒及其用途，涉及海洋软体动物细胞培养。设有包装盒、洗液I瓶、洗液II瓶、洗液III瓶、溶液A瓶、溶液B瓶、溶液C瓶、使用说明书；洗液I瓶、洗液II瓶、洗液III瓶、溶液A瓶、溶液B瓶、溶液C瓶、使用说明书设在包装盒内。试剂盒在多种海洋软体动物多种体细胞的无菌分离与体外原代培养中应用。通过对海洋软体动物细胞分离和原代培养的条件进行优化，获得适合海洋软体动物细胞分离与原代培养适合条件，解决现有技术无法实现的海洋软体动物细胞快速分离与原代细胞无菌培养体系快速建立的问题，建立海洋软体动物原代细胞快速分离与原代细胞无菌方法，给出海洋软体动物原代细胞分离与培养试剂盒。

Marine mollusk primary cell isolation and culture kit and use thereof

The utility model relates to a primary isolation and culture kit for marine mollusks and the use thereof, relating to the culture of marine mollusk cells. The packing box is provided with a I bottle of lotion, lotion, lotion bottle, II bottle, III bottle, B bottle solution A solution, C solution bottle and instructions for use; lotion I bottle, II bottle, III bottle of lotion lotion, solution A bottle, B bottle, C bottle solution solution, instructions for use in packing box. The kit was applied to the isolation and primary culture of various marine mollusks in vitro. To optimize the cultivation of marine mollusks through animal cell isolation and primary conditions for marine mollusks of animal cell isolation and primary culture of suitable conditions, solve the rapid isolation and culture system quickly established and primary cells cannot achieve aseptic existing technology of soft bodied marine animal cells, the establishment of marine animal software rapid separation of primary cells and the primary cell culture kit and sterile method, primary animal cell separation are marine mollusks.

【技术实现步骤摘要】
一种海洋软体动物原代细胞分离与培养试剂盒及其用途
本专利技术涉及海洋软体动物细胞培养，尤其是涉及一种海洋软体动物原代细胞分离与培养试剂盒及其用途。
技术介绍
细胞培养是现代生物工程技术中的重要技术与常用方法之一，广泛应用于细胞代谢、基因转录、蛋白质表达、细胞环境应急与免疫机制、药物筛选与生物药物表达生产等研究领域。在植物、哺乳动物、鱼类和昆虫的研究中，细胞与组织培养已经成为不可或缺的研究手段，特别是在相关基因表达调控机制、细胞信号转导通路、细胞环境应激机制、以及遗传与突变研究等方面，细胞培养已经成为无法替代的手段，也是促进现代生物技术快速发展的重要技术。但是，在海洋软体动物细胞培养领域，因为海洋软体动物细胞形态、功能分化、结构与营养需求等方面的特殊性，至今仍然没有建立起永生细胞系，原代细胞培养仍然是主要依托的方法([1]VillenaAJ.RevFishBiolFish,2003,13:111；[2]李建军，黄宝玉.海洋通报,2015(3):247-251)。然而，即使是原代细胞培养，目前可选择用于海洋软体动物细胞分离与原代培养的试剂盒相关产品依然十分有限，严重影响了海洋软体动物细胞学相关研究与应用技术的发展。软体动物因为应用广泛，其细胞培养研究是无脊椎动物中开展的最早最广泛的，培养对象包括一些养殖的经济贝类，组织细胞包括胚胎、鳃、外套膜、血细胞和心肌等多种组织来源。在20世纪70年代，Hansen等([3]RinkevichB.JBiotechnol,1999,70:133)从淡水蜗牛成功建立了胚胎细胞系BGE，这也是水生无脊椎动物中唯一细胞系。但是，几十年过去了，海洋软体动物至今还没有成功建立一个细胞系，其细胞培养遭遇长期的失败，大部分细胞培养的尝试，通常在体外只能培养比较短的时间，同时微生物污染一直威胁着原代细胞培养，也是最终培养失败的主要原因之一。至今，海洋软体动物细胞培养主要集中在原代细胞培养条件的改进方面，特别是培养基的优化。相对较为成功的例子包括，Merwe等([4]VanderMerweM，Auzoux-BordenaveS，NieslerC.Cytotechnology，2010，62(3):265－277.)报道成果原代培养了鲍外套膜血淋巴等组织细胞。Odintsova等([5]OdintsovaNA，DyachukVA，NezlinLP.CellandTissueResearch，2010，339(3):625-637)报道将Mytilustrossulus的幼体细胞原代培养了70多天。目前，研究人员普遍认识到海洋软体动物细胞的营养需求和生长条件与脊椎动物差异显著。海洋软体动物原代细胞培养条件优化多集中改善原代细胞培养的营养因子与细胞生长因子。L15基础培养基是公认的相对比较适合软体动物细胞培养的基础培养基，胎牛血清也普遍被用于海洋软体动物的细胞培养，小牛血清或者待培养动物的组织提取液或血淋巴液也被报道能促进原代细胞的生长与分裂，他们的使用量大多控制在5-20％([6]ChenSNetal.MethodsCellSci,1999,21:183)。虽然研究者们对海洋软体动物细胞培养开展了大量探索性的研究工作，但是目前仍然没有适用于海洋软体动物细胞培养的普适性方法、培养基以及试剂盒，海洋软体动物细胞培养工作进展十分缓慢。多种海洋软体动物是我国重要的海洋经济养殖种类，具有重要的食用价值和经济价值，有些还有很好的药用价值，在基础海洋水产生物的研究中也具有重要地位。因此，海洋软体动物的基础生物学、分子生物学、遗传学、基因功能学、育种学等各领域的研究方兴未艾，非常需要稳定的细胞培养体系提供不可或缺的研究手段，在缺乏细胞系的情况下，专利技术可用于快速建立海洋软体动物细胞分离与原代细胞培养的方法和相应的快捷试剂盒，具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种海洋软体动物原代细胞分离与培养试剂盒及其用途，所述海洋软体动物原代细胞分离与培养试剂盒设有包装盒、洗液I瓶、洗液II瓶、洗液III瓶、溶液A瓶、溶液B瓶、溶液C瓶、使用说明书；所述洗液I瓶、洗液II瓶、洗液III瓶、溶液A瓶、溶液B瓶、溶液C瓶、使用说明书设在包装盒内；所述洗液I瓶内装有洗液I，所述洗液I含有100μg/mL氨苄青霉素、100μg/mL链霉素、60μg/mL青霉素、8μg/mL制霉素、50μg/mL庆大霉素的无菌滤过海水；所述洗液II瓶内装有洗液II，所述洗液II含有200μg/mL氨苄青霉素、200μg/mL链霉素、120μg/mL青霉素、16μg制霉素、100μg/mL庆大霉素的无菌滤过海水；所述洗液III瓶内装有洗液III，所述洗液III用无菌超纯水配制含20.8g/L葡萄糖、22.5g/L氯化钠、3.36g/LEDTA-2Na、8g/L枸盐酸钠pH＝7.25的与海水等渗的螯合缓冲液；所述溶液A瓶内装有溶液A，所述溶液A是用氯化钠调节渗透压摩尔浓度为1000mOsmol/kg的胰蛋白酶消化液；所述溶液B瓶内装有溶液B，所述溶液B是在L-15细胞培养液中添加氨苄青霉素100μg/mL、青霉素60μg/mL、链霉素100μg/mL、制霉素8μg/mL、庆大霉素50μg/mL、葡萄糖20.8g/L、氯化钠20.2g/L、氯化钾0.54g/L、氯化镁3.9g/L、氯化钙0.6g/L、硫酸镁1g/L、人重组表皮生长因子10ng/mL、海绵吡咯醛烷烃100ng/mL、谷氨酰胺2mmol/L；所述溶液C瓶内装有溶液C，所述溶液C是含透析FBS与透析血淋巴液体积比为2︰1的血清系统。所述洗液I最好分装入3瓶100mL无菌密封瓶，贴上标签，-20～4℃保存。所述洗液II最好分装入3支100mL无菌密封瓶，贴上标签，-20～4℃保存。所述洗液III最好分装入50mL无菌密封瓶，贴上标签，-20～4℃保存。所述溶液A最好分装入15mL无菌密封瓶，贴上标签，-20～4℃保存。所述溶液B最好分装入50mL无菌密封瓶，贴上标签，-20～4℃保存。所述溶液C最好分装入10mL无菌密封瓶，贴上标签，-20～4℃保存。所述海洋软体动物原代细胞分离与培养试剂盒可在多种海洋软体动物多种体细胞的无菌分离与体外原代培养中应用，所述多种海洋软体动物多种体细胞包括牡蛎、鲍、文蛤、扇贝、贻贝等软体动物的鳃、外套膜、肌肉、血淋巴等多种组织细胞。本专利技术通过对海洋软体动物细胞分离和原代培养的条件进行优化，获得了适合海洋软体动物细胞分离与原代培养适合条件，解决了现有技术无法实现的海洋软体动物细胞快速分离与原代细胞无菌培养体系快速建立的问题，建立海洋软体动物原代细胞快速分离与原代细胞无菌方法，给出海洋软体动物原代细胞分离与培养试剂盒。本专利技术的有益效果：使用本专利技术可以快速简便地将海洋软体动物细胞进行体外分离制备与培养，培养的细胞存活率高，受微生物污染率低，细胞可传代和继代培养时间长达20～90天。本专利技术的主要技术原理是通过使用含有多种广谱抗生素联用的无菌滤过海水经8次短(30s)时间剧烈震荡，对海洋软体动物组织进行清洗即可除去几乎所有附着于组织上的微生物，大大减少微生物污染的概率；海水等渗的金属离子螯合缓冲液和与海水等渗的胰蛋白酶消化液，都能够保证在分离培养过程中，使本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种海洋软体动物原代细胞分离与培养试剂盒，其特征在于其设有包装盒、洗液I瓶、洗液II瓶、洗液III瓶、溶液A瓶、溶液B瓶、溶液C瓶、使用说明书；所述洗液I瓶、洗液II瓶、洗液III瓶、溶液A瓶、溶液B瓶、溶液C瓶、使用说明书设在包装盒内；所述洗液I瓶内装有洗液I，所述洗液I含有100μg/mL氨苄青霉素、100μg/mL链霉素、60μg/mL青霉素、8μg/mL制霉素、50μg/mL庆大霉素的无菌滤过海水；所述洗液II瓶内装有洗液II，所述洗液II含有200μg/mL氨苄青霉素、200μg/mL链霉素、120μg/mL青霉素、16μg制霉素、100μg/mL庆大霉素的无菌滤过海水；所述洗液III瓶内装有洗液III，所述洗液III用无菌超纯水配制含20.8g/L葡萄糖、22.5g/L氯化钠、3.36g/LEDTA‑2Na、8g/L枸盐酸钠pH＝7.25的与海水等渗的螯合缓冲液；所述溶液A瓶内装有溶液A，所述溶液A是用氯化钠调节渗透压摩尔浓度为1000mOsmol/kg的胰蛋白酶消化液；所述溶液B瓶内装有溶液B，所述溶液B是在L‑15细胞培养液中添加氨苄青霉素100μg/mL、青霉素60μg/mL、链霉素100μg/mL、制霉素8μg/mL、庆大霉素50μg/mL、葡萄糖20.8g/L、氯化钠20.2g/L、氯化钾0.54g/L、氯化镁3.9g/L、氯化钙0.6g/L、硫酸镁1g/L、人重组表皮生长因子10ng/mL、海绵吡咯醛烷烃100ng/mL、谷氨酰胺2mmol/L；所述溶液C瓶内装有溶液C，所述溶液C是含透析FBS与透析血淋巴液体积比为2︰1的血清系统。...

【技术特征摘要】
1.一种海洋软体动物原代细胞分离与培养试剂盒，其特征在于其设有包装盒、洗液I瓶、洗液II瓶、洗液III瓶、溶液A瓶、溶液B瓶、溶液C瓶、使用说明书；所述洗液I瓶、洗液II瓶、洗液III瓶、溶液A瓶、溶液B瓶、溶液C瓶、使用说明书设在包装盒内；所述洗液I瓶内装有洗液I，所述洗液I含有100μg/mL氨苄青霉素、100μg/mL链霉素、60μg/mL青霉素、8μg/mL制霉素、50μg/mL庆大霉素的无菌滤过海水；所述洗液II瓶内装有洗液II，所述洗液II含有200μg/mL氨苄青霉素、200μg/mL链霉素、120μg/mL青霉素、16μg制霉素、100μg/mL庆大霉素的无菌滤过海水；所述洗液III瓶内装有洗液III，所述洗液III用无菌超纯水配制含20.8g/L葡萄糖、22.5g/L氯化钠、3.36g/LEDTA-2Na、8g/L枸盐酸钠pH＝7.25的与海水等渗的螯合缓冲液；所述溶液A瓶内装有溶液A，所述溶液A是用氯化钠调节渗透压摩尔浓度为1000mOsmol/kg的胰蛋白酶消化液；所述溶液B瓶内装有溶液B，所述溶液B是在L-15细胞培养液中添加氨苄青霉素100μg/mL、青霉素60μg/mL、链霉素100μg/mL、制霉素8μg/mL、庆大霉素50μg/mL、葡萄糖20.8g/L、氯化钠20.2g/L、氯化钾0.54g/L、氯化镁3...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗联忠，许莉，庄玲萍，孔雪，柯仙童，刘钟晓，
申请(专利权)人：厦门医学院，
类型：发明
国别省市：福建,35