【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物检测，具体涉及一种基于等温扩增技术的高危型hpv可视化检测方法。
技术介绍
1、环介导等温扩增技术是一种在恒温条件下进行的dna扩增方法，其原理是利用环介导dna聚合酶(bstdnapolymerase)的特殊性质，实现dna的快速扩增。该技术具有操作简便、扩增效率高、无需高精度温控设备等优点，因此在基因检测领域得到了广泛的应用。
2、横向流动试纸条是一种基于毛细管作用和反应物在纸张上的扩散效应的分析方法。通过在试纸条上固定检测目标的特异性探针和信号产生反应物，结合上样样品后，样品中的目标分子与探针发生特异性的反应，形成可视化的颜色信号，从而实现目标分子的快速检测。
3、超过90％的女性一生中至少有一次感染hpv，即宫颈癌患病潜在人群大，产品需求市场大。及早进行宫颈癌早筛，发现宫颈癌前病变并治疗是降低宫颈癌发病率和死亡率的关键。且hpv检测初筛为后续进一步诊断治疗起到决定性作用，进行准确高效的宫颈癌筛查分流可避免不必要的阴道镜转诊，有效减少医疗资源的浪费。
4、然而，宫颈癌筛查覆盖率低、现有宫颈癌检测方法灵敏度低、检测核酸扩增耗时长、检测成本高昂，且假阳性率高是亟待解决的问题。
5、鉴于此，本申请提出了一种基于等温扩增技术的高危型hpv可视化检测方法，其所制作的横向试纸条能够应用于宫颈癌的早期筛查。
技术实现思路
1、为了克服现有宫颈癌筛查覆盖率低、现有宫颈癌检测方法灵敏度低且假阳性率高等问题，本专利技术的目的在于提
2、本专利技术为了实现上述目的所采用的技术方案为：
3、一种基于等温扩增技术的高危型hpv可视化检测方法，该方法包括以下步骤：
4、s1、对hpv核酸样本进行lamp等温扩增反应，获得阳性核酸扩增产物，其中阳性核酸扩增产物为同时带有生物素和异硫氰酸荧光素或同时带有生物素和地高辛的双标记产物；
5、s2、制备胶体金侧向层析试条，胶体金侧向层析试条的检测线t1处包被有抗异硫氰酸抗体，检测线t2处包被有抗地高辛抗体，标记垫层胶体金胶微球上标记有抗生物素抗体；
6、s3、将阳性核酸扩增产物滴加到胶体金侧向层析试条上，生物素与抗生物素抗体结合，形成fitc-dna-生物素-生物素抗体-胶体金复合物或digoxin-dna-生物素-生物素抗体-胶体金复合物；
7、s4、当阳性核酸扩增产物流至检测线t1处时，fitc-dna-生物素-生物素抗体-胶体金复合物以其异硫氰酸荧光素被检测线t1处上的抗异硫氰酸抗体捕获显示红色线，检测结果为hpv16型阳性；
8、当阳性核酸扩增产物流至检测线t2处时，digoxin-dna-生物素-生物素抗体-胶体金复合物以其地高辛被检测线t2处上的地高辛抗体捕获显示红色线，检测结果为hpv18型阳性。
9、通过上述技术方案，本申请通过环介导等温扩增技术实现在恒温条件下hpv基因指数级扩增，并结合胶体金免疫层析技术，将引物fitc(异硫氰酸)/digoxin(地高辛)和biotin(生物素)偶联实现了层析试纸对目标核酸的捕获，能够弥补现有宫颈癌检测不足，突破设备束缚，提高检测结果准确性，诊断结果可视化，实现居家自测，提升检测的便携性，大幅度降低宫颈癌筛查的成本以提高宫颈癌筛查覆盖率。
10、在一个优选的实施例中，该方法还包括：fitc-dna-生物素-生物素抗体-胶体金复合物或者digoxin-dna-生物素-生物素抗体-胶体金复合物流至胶体金侧向层析试条的质控线c处时，剩余的生物素抗体-胶体金复合物与质控线c处包被的羊抗鼠抗体结合显示红色线，指示检测结果有效可控。
11、通过上述技术方案，方便测试人员知晓所测得的结果是否有效可控。
12、在一个优选的实施例中，步骤s1具体包括以下子步骤：
13、s11、通过ncbi网站查找并下载全部hpv高危病毒亚型的基因序列和全部的hpv高危亚型变异株病毒的基因序列；
14、s12、通过mega序列比对软件将hpv高危病毒亚型的基因序列与hpv高危亚型变异株病毒的基因序列一一进行对比，找出1000bp的保守碱基序列作为靶序列；
15、s13、利用lamp引物设计软件对保守碱基序列的6个不同的区域设计出4-6条特异性引物，特异性引物包括hpv16的lamp引物和hpv18的lamp引物。
16、通过上述技术方案，由于是针对靶序列6个区域设计的4-6种特异性引物，6个区域中任何区域与引物不匹配均不能进行核酸扩增，故其特异性极高。
17、环介导等温扩增技术依靠4-6条特异性引物和一种具有链置换活性的dna聚合酶(bstdna聚合酶)，在等温条件(60-65℃)下扩增靶序列，避免传统的pcr需要变温扩增而对精密仪器的依赖性，同时具有快速、高效、特异性强的特点。但是影响的因素很多，如反应温度，引物浓度，酶mg2+等因素。因此，本申请进行实验设计时综合运用单因素试验与响应面分析法,首先确定了各因素的有效范围,再对三因素三水平进行组合优化，获得最佳反应体系。具体如下：
18、单因素试验：不同酶的应用、聚合酶最佳的反应温度、最佳反应时间等不同因素。分别进行对照实验探究不同条件对于dna扩增速率的影响。
19、响应面分析法：响应面分析法(也称响应曲面法)是一种简便的优化方法，将体系的响应作为一个或多个因素的函数，运用图形技术将这种函数关系显示出来。由单因素试验确定水平→根据实验对比数据设计实验，获取实验数据→利用实验数据获取回归方程即响应面方程→利用响应面进行分析。验设计与优化方法，找出最优值，判别优化区域。
20、组合优化：经过单因素实验和响应面分析法得到判别优化区域，再进行具体对应实验绘制出直观的图形，观察其最优化点，找出最优值。
21、经过三因素三水平组合优化，最终确定hpv16的lamp引物为：
22、
23、其中，f3和b3为外引物，fip和bip为内引物，loopf和loopb为环引物。
24、经过三因素三水平组合优化，最终确定hpv18的lamp引物为：
25、
26、其中，f3和b3为外引物，fip和bip为内引物，loopf和loopb为环引物。
27、在一个优选的实施例中，lamp等温扩增反应体系包括以下检测组分：
28、 试剂 用量/μl 浓度 聚合酶反应缓冲液 2.5 10x 本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种基于等温扩增技术的高危型HPV可视化检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种基于等温扩增技术的高危型HPV可视化检测方法，其特征在于，还包括：所述FITC-DNA-生物素-生物素抗体-胶体金复合物或者DIGoxin-DNA-生物素-生物素抗体-胶体金复合物流至所述胶体金侧向层析试条的质控线C处时，剩余的生物素抗体-胶体金复合物与质控线C处包被的羊抗鼠抗体结合显示红色线，指示检测结果有效可控。
3.根据权利要求1所述的一种基于等温扩增技术的高危型HPV可视化检测方法，其特征在于，步骤S1具体包括以下子步骤：
4.根据权利要求3所述的一种基于等温扩增技术的高危型HPV可视化检测方法，其特征在于，所述HPV16的LAMP引物为：
5.根据权利要求3所述的一种基于等温扩增技术的高危型HPV可视化检测方法，其特征在于，所述HPV18的LAMP引物为：
6.根据权利要求1所述的一种基于等温扩增技术的高危型HPV可视化检测方法，其特征在于，LAMP等温扩增反应体系包括以下检测组分：
7.根
8.根据权利要求1所述的一种基于等温扩增技术的高危型HPV可视化检测方法，其特征在于，在步骤S2中，制备胶体金侧向层析试条包括：将样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸收垫和衬底五部分首尾相连组成所述胶体金侧向层析试条。
9.根据权利要求1所述的一种基于等温扩增技术的高危型HPV可视化检测方法，其特征在于，还包括：对HPV核酸样本进行LAMP等温扩增反应，若无扩增产物，则FITC-DNA-生物素-生物素抗体-胶体金复合物或者DIGoxin-DNA-生物素-生物素抗体-胶体金复合物不被所述检测线T1处上的抗异硫氰酸抗体捕获，也不被所述检测线T2处上的地高辛抗体捕获，在质控线C处被生物素捕捉显示红色线。
10.根据权利要求1所述的一种基于等温扩增技术的高危型HPV可视化检测方法，其特征在于，还包括：待所述阳性核酸扩增产物进入所述胶体金侧向层析试条的样品孔后，将所述胶体金侧向层析试条垂直放置在含有缓冲液的浸泡盒中，使缓冲液与所述胶体金侧向层析试条充分接触，通过毛细作用，所述阳性核酸扩增产物会沿着所述胶体金侧向层析试条上升，所述阳性核酸扩增产物与所述胶体金侧向层析试条上特定的探针结合。
...【技术特征摘要】
1.一种基于等温扩增技术的高危型hpv可视化检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种基于等温扩增技术的高危型hpv可视化检测方法，其特征在于，还包括：所述fitc-dna-生物素-生物素抗体-胶体金复合物或者digoxin-dna-生物素-生物素抗体-胶体金复合物流至所述胶体金侧向层析试条的质控线c处时，剩余的生物素抗体-胶体金复合物与质控线c处包被的羊抗鼠抗体结合显示红色线，指示检测结果有效可控。
3.根据权利要求1所述的一种基于等温扩增技术的高危型hpv可视化检测方法，其特征在于，步骤s1具体包括以下子步骤：
4.根据权利要求3所述的一种基于等温扩增技术的高危型hpv可视化检测方法，其特征在于，所述hpv16的lamp引物为：
5.根据权利要求3所述的一种基于等温扩增技术的高危型hpv可视化检测方法，其特征在于，所述hpv18的lamp引物为：
6.根据权利要求1所述的一种基于等温扩增技术的高危型hpv可视化检测方法，其特征在于，lamp等温扩增反应体系包括以下检测组分：
7.根据权利要求1所述的一种基于等温扩增技术的高危型hpv可视化检测方法，其特征在于，所述lamp...
【专利技术属性】
技术研发人员：蔡文凯，祝珊珊，田忠富，郝宗杰，苏业俣，罗家英，
申请(专利权)人：厦门医学院，
类型：发明
国别省市：
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