【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程，尤其涉及一种天冬氨酸-α-脱羧酶突变体及其应用。
技术介绍
1、d-泛酸又称维生素b5，化学分子式c9h17no5，相对分子量219.24，是一种重要的水溶性维生素。d-泛酸及其衍生物在食品、医药、饲料、化妆品等领域有广泛的应用。在食品领域，d-泛酸可作为一种食品营养强化剂可用于多种食品添加以补充营养成分；在医药方面，d-泛酸作为人体必需的维生素普遍存在于生物体内，其衍生物d-泛酸钙的单方制剂可用于治疗d-泛酸缺乏症，与其他组分构成的复方制剂可用于治疗神经炎、神经衰弱、术后肠绞痛和呼吸道等疾病，同时也可用于多种保健食品等；在饲料方面，饲料中添加一定剂量的d-泛酸能满足猪、鸡和鱼类等生长发育、脂肪代谢的需求，避免出现生长迟缓、适应性及抗病性下降、生殖系统障碍、毛发脱落的现象；在化妆品方面，d-泛酸及其衍生物d-泛醇与皮肤、毛发的营养状态息息相关，可用于防治毛发干枯和损伤，提高毛发营养使其光线亮泽。并且有增加保湿和抗老化的作用，促进皮肤对营养成分的吸收，广泛应用与保湿霜、护发液和乳液等化妆品。
2、目前生产d-泛酸的方法主要有三种：化学合成法，酶催化法和发酵合成法。
3、化学合成法，先通过化学法制备得到前体物β-丙氨酸和d,l-泛解酸内酯，再合成d-泛酸。其中的β-丙氨酸主要通过丙烯腈法、丙烯酸法和琥珀酸亚胺法合成得到，而d,l-泛解酸内酯主要通过异丁醛-甲醛法、异丁醛-醛乙酸法和异丁醛-三氯甲烷法制备得到，但是化学法高耗能、对设备损耗大，同时产生对人体和环境的有害物质。得到上述中间体
4、酶法合成d-泛酸，利用微生物来源的泛酸合成酶，以d-泛解酸和β-丙氨酸为底物完成d-泛酸的合成，但是其前体物d-泛解酸和β-丙氨酸仍需要化学合成得到。
5、发酵法合成d-泛酸，是利用基因编辑手段对工程菌进行代谢改造发酵生产d-泛酸。利用生物发酵法生产d-泛酸产品，可以利用葡萄糖等廉价的工业原料、经过生物体自身代谢反应而得到d-泛酸产品，通过合理运用微生物来生产d-泛酸，不仅能够保证泛酸的拆分质量而且还能降低反应成本。相较化学法，生物法具有更加绿色环保的优点。但生物发酵法存在发酵过程不稳定、产量不高等问题。
技术实现思路
1、为了解决上述现有生物发酵合成d-泛酸产量不高的技术问题，本专利技术提供了一种天冬氨酸-α-脱羧酶突变体及其应用。本专利技术通过对来源于枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)的pand基因进行定点突变，得到一种天冬氨酸-α-脱羧酶突变体，扩大了底物与酶的结合口袋，同时提高了对底物的亲和能力，在加强天冬氨酸脱羧的同时，将代谢流拉至β-丙氨酸途径，基于该突变体及其编码基因构建的工程菌，在加强β-丙氨酸生成的同时，促进了d-泛酸的合成。
2、本专利技术的具体技术方案为：
3、一方面，本专利技术提供了一种天冬氨酸-α-脱羧酶突变体，该突变体与来源于枯草芽孢的pand基因编码的天冬氨酸-α-脱羧酶相比，其进行了以下位点的单点突变或组合突变：
4、(1)31号位点的天冬氨酸突变成谷氨酸；
5、(2)45号位点的谷氨酸突变成脯氨酸；
6、(3)55号位点的亮氨酸突变成苯丙氨酸；
7、(4)61号位点的脯氨酸突变成丙氨酸；
8、(5)64号位点的精氨酸突变成脯氨酸；
9、(6)83号位点的天冬氨酸突变成谷氨酸；
10、(7)88号位点的异亮氨酸突变成甲硫氨酸；
11、(8)89号位点的丝氨酸突变成丙氨酸。
12、本专利技术通过对来源于枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)的pand基因进行以上位点的的单点突变或组合突变，得到一种天冬氨酸-α-脱羧酶突变体，扩大了底物与酶的结合口袋，同时提高了对底物的亲和能力，在加强天冬氨酸脱羧的同时，将代谢流拉至β-丙氨酸途径，基于该突变体及其编码基因构建的工程菌，在加强β-丙氨酸生成的同时，促进了d-泛酸的合成。
13、具体地，本专利技术以来源于枯草芽孢的pand基因编码的天冬氨酸-α-脱羧酶进行上述位点的单点突变为例，得到8种突变体，基于此，构建得到8种高产d－泛酸的基因工程菌。其中，8种突变体酶活均有明显提升，基因工程菌摇瓶发酵48h后，相比于野生型，d-泛酸效价提升可达621％。由此证明上述突变在构建高产d-泛酸工程菌中的重要性。
14、此外，在本专利技术给出了上述位点单点突变及其突变类型后，本领域技术人员不难推测，上述位点的组合突变，也应有类似的作用效果，因此，上述给定位点及其类型的组合突变，也应纳入本专利技术的保护范围。
15、作为本专利技术上述技术方案的优选，与来源于枯草芽孢的pand基因编码的天冬氨酸-α-脱羧酶相比，其进行了以下位点的单点突变：
16、(1)31号位点的天冬氨酸突变成谷氨酸；
17、(2)45号位点的谷氨酸突变成脯氨酸；
18、(3)55号位点的亮氨酸突变成苯丙氨酸；
19、(4)61号位点的脯氨酸突变成丙氨酸；
20、(5)64号位点的精氨酸突变成脯氨酸；
21、(6)83号位点的天冬氨酸突变成谷氨酸；
22、(7)88号位点的异亮氨酸突变成甲硫氨酸；
23、(8)89号位点的丝氨酸突变成丙氨酸。
24、本专利技术以以上位点的单点突变为例，给出了8种突变体在发酵生产d－泛酸中的实际应用。8种突变体酶活均有明显提升，基因工程菌摇瓶发酵48h后，相比于野生型，d-泛酸效价提升可达621％。
25、作为本专利技术上述技术方案的优选，所述天冬氨酸-α-脱羧酶突变体的编码基因的核苷酸序列如seq id no.2、seq id no.3、seq id no.4、seq id no.5、seq id no.6、seqid no.7、seq id no.8或seq id no.9所示。
26、同时，本专利技术提供了编码上述天冬氨酸-α-脱羧酶突变体的基因。
27、基于本专利技术上述的单点突变或组合突变，得到的天冬氨酸-α-脱羧酶突变体，本领域技术人员可以在不付出任何智慧劳动的情况下获得其编码基因，因此，其本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种天冬氨酸-α-脱羧酶突变体，其特征在于：与来源于枯草芽孢的panD基因编码的天冬氨酸-α-脱羧酶相比，其进行了以下位点的单点突变或组合突变：
2.如权利要求1所述的一种天冬氨酸-α-脱羧酶突变体，其特征在于：与来源于枯草芽孢的panD基因编码的天冬氨酸-α-脱羧酶相比，其进行了以下位点的单点突变：
3.如权利要求2所述的一种天冬氨酸-α-脱羧酶突变体，其特征在于：所述天冬氨酸-α-脱羧酶突变体的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8或SEQ ID NO.9所示。
4.编码权利要求1所述天冬氨酸-α-脱羧酶突变体的基因。
5.携带权利要求4所述基因的重组表达载体。
6.如权利要求5所述的重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体为质粒、噬菌体或病毒载体。
7.携带权利要求4所述基因或权利要求5所述重组质粒的宿主细胞。
8.如权利要求7所述的细胞，
9.如权利要求7所述的细胞的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：
10.权利要求1～3任一项所述天冬氨酸-α-脱羧酶突变体，或权利要求4所述基因，或权利要求5～6任一项所述重组表达载体，或权利要求7～8任一项所述细胞，或权利要求9所述方法构建得到的细胞在制备D-泛酸或含D-泛酸的产品中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种天冬氨酸-α-脱羧酶突变体，其特征在于：与来源于枯草芽孢的pand基因编码的天冬氨酸-α-脱羧酶相比，其进行了以下位点的单点突变或组合突变：
2.如权利要求1所述的一种天冬氨酸-α-脱羧酶突变体，其特征在于：与来源于枯草芽孢的pand基因编码的天冬氨酸-α-脱羧酶相比，其进行了以下位点的单点突变：
3.如权利要求2所述的一种天冬氨酸-α-脱羧酶突变体，其特征在于：所述天冬氨酸-α-脱羧酶突变体的编码基因的核苷酸序列如seq id no.2、seq id no.3、seq id no.4、seqid no.5、seq id no.6、seq id no.7、seq id no.8或seq id no.9所示。
4.编码权利要求1所述天...
【专利技术属性】
技术研发人员：柳志强，周俊平，王屹竑，冯雪云，张博，黄良刚，郑裕国，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：
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