一种细胞培养用SFL微载体及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供一种细胞培养用SFL微载体的制备方法，包括以下步骤：（1）蚕茧脱胶；（2）配制纯丝素蛋白溶液；（3）采用W/O/O复乳法制备微球；（4）交联固化成球；（5）除油洗涤；（6）还原脱色；（7）洗涤。本发明专利技术还提供应用该方法制备得到的细胞培养用SFL微载体及其应用。本发明专利技术原料无毒性，采取W/O/O复乳法乳化成球，一定温度下交联固化，无需再次偶联修饰，得到的微载体表面呈多孔，比表面积大、生物相容性好、适合多种细胞培养使用。整个制备过程简单易行，方法可控，成本低廉，生物安全性高，易于工业化生产，本发明专利技术的微载体能够在搅拌状态下悬浮培养，适合于多种贴壁细胞大规模悬浮培养，具有广阔的市场前景。

【技术实现步骤摘要】
一种细胞培养用SFL微载体及其制备方法和应用
本专利技术涉及一种细胞培养用SFL微载体及其制备方法和应用。
技术介绍
微载体培养技术是研究动物细胞的结构、功能和分化、以及生产许多重要的生物制品如疫苗、酶类、激素、抗体、干扰素和核酸等所必需的技术。目前，动物细胞大规模化培养的主要方式为微载体贴壁培养技术和全悬浮培养技术。但全悬浮培养技术尚不成熟，仅限于少数细胞系能实现。而大多数贴壁依赖型动物细胞都可用微载体进行培养。动物细胞的微载体培养技术能把悬浮培养和贴壁培养融合在一起，兼具两者的优点，放大容易，培养基利用率较高，培养条件（温度、pH值、CO2浓度等）易控制，能起到保护细胞抵抗物理和化学压力的作用，且培养过程可实现系统化、自动化，减少劳动力需求，不易被污染。因此，微载体培养技术是当前动物细胞大规模培养的发展趋势。自1967年VanWezel第一个用DEAE-SephadexA50作为贴壁细胞培养用微载体以来，研究报道的细胞培养用微载体已有十多种，包括葡聚糖微载体、聚赖氨酸液体微载体、大孔明胶微载体、纤维素微载体、壳聚糖微载体、甲壳素微载体、聚苯乙烯微载体、聚氨酯泡沫微载体、藻酸盐凝胶微载体以及磁性微载体等。国外商品化的微载体主要有：如GE公司的Cytodex1、Cytodex2、Cytodex3和Cytopore、Cytoline、Biosilon、CultispherG等，但这些进口产品价格昂贵，目前市场价已达4-10万元/kg(以Cytodex系列为例)，还出现供不应求的现象，国内的市场几乎已被国外公司垄断。国内对细胞培养用微载体的研究起步较晚，生产规模较小，难以工业化生产，目前尚无商品化的微载体面世，远不能满足我国生物制药领域疫苗、重组药物蛋白、单克隆抗体、细胞因子及其受体等医用生物制品生产的需要，所有生物疫苗企业都是用进口产品，并且外国公司的产品每年都在涨价。造成此现象的原因很多，如技术难度大，技术和研发人员分散，所需资金投入大，研发周期长等。目前，在发达国家，生物制药行业贴壁依赖型动物细胞培养工艺已普遍采用生物反应器微载体培养工艺，几千升、上万升的动物细胞培养生物反应器已用于抗体或人用及兽用疫苗的生产，微载体细胞培养的规模已达到6000L以上。而我国绝大多数疫苗类制药行业仍然沿用传统的转瓶（滚瓶）培养工艺，该工艺劳动强度大，细胞产量低，产品批间差异大，容易造成污染，耗时耗力，导致我国绝大多数生物制药企业的产品生产成本高，产值低，无法与国外产品竞争。要提高产品竞争力，只有采用自主研发的生物反应器微载体大规模培养技术。微载体原料首选要求：①无毒性；②优良的生物相容性和可生物降解；③天然的高聚物；④价格低廉。丝素蛋白为天然材料，来源广泛，非哺乳动物源性，生物相容性优良，含有丰富的起细胞粘附作用的精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸三肽序列，能支持多种细胞的黏附、增殖和分化。以其为原料制备微载体是当前的研究热点，且目前尚无商品化的丝素蛋白微载体。我国是产丝大国，家蚕蚕茧和年生丝量分别为68万吨和817万吨，占全世界总产量的70%；柞蚕的总产量占全世界的90%左右。我国蚕丝行业产量区域集中度非常高，据2013年统计数据显示，蚕丝产量主要集中在华东、华南、西南地区，产量分别占同期全国总产量的39.2%、27.1%、26.1%。近年来，国内外有关丝素蛋白高值化利用的研究颇多，丝素蛋白微球的制备方法层出不穷，但迄今为止仍未有商品化的SFL微载体。在丝绸生产过程中难免产生废丝，其数量可观，廉价易得，从资源节约和综合利用方面出发，开展对SFL微载体的开发研究有着重要的意义。目前，国内外纯丝素蛋白微球的制备仍存在易成球、难交联且球形不规则等问题，故制备方法层出不穷，有酶法、喷雾干燥法、乳化法、相分离法、电喷法和超临界二氧化碳流体强制分散法等，有的新技术工艺复杂，难以产业化。如2015年塔夫茨大学戴维·L卡普兰，T·于赛尔等申请的专利技术专利“用于制备丝微球的方法和组合物”，其采用喷雾-结晶-冷冻-干燥工艺制备丝素蛋白微球，工艺复杂，尺寸难控，形状不规则，难以工业化生产。再如2010年苏州大学王璐，李明忠，吕强等申请的专利技术专利“一种丝素蛋白微载体及其制备方法”，其制备方法为同轴高压静电技术和冷冻干燥法，这种方法对设备要求高，工业化生产受限；2016年武汉纺织大学卢晨等在进展与述评杂志上发表了“蚕丝蛋白微球制备方法的研究进展”一篇文章，文章阐述了丝素蛋白微球作为药物缓释载体具有巨大潜力。但是在目前丝素蛋白微球的制备过程中仍然存在易成球、难交联和分散性差等问题。尽管对丝素蛋白微球的研究己取得了很多创新性成果，但至今仍未有真正市场化的产品出现。另外，国内外大部分报道关于“丝素蛋白微球”的文献多半是丝素蛋白与其他材料制成复合材料微球，纯的丝素蛋白微球还未研制成功。因此，综合开发利用蚕茧，开发多元化产品，开发出急需的微载体品种替代国外产品是一件利国利民的事。
技术实现思路
为了解决现有技术中存在的问题，本专利技术提供了一种细胞培养用丝素蛋白微载体（简称SFL微载体）及其制备方法和应用。该制备方法具有以下特点：采用天然的蚕茧，原料无毒性，采取W/O/O复乳法乳化成球，一定温度下交联固化，无需再次偶联修饰，整个制备过程简单易行，方法可控，成本低廉，生物安全性高，易于工业化生产，本专利技术的微载体能够在搅拌状态下悬浮培养，适合于多种贴壁细胞大规模悬浮培养。本专利技术提供一种细胞培养用SFL微载体的制备方法，包括以下步骤：（1）蚕茧脱胶：将蚕茧在Na2CO3溶液中进行脱胶，获得丝素蛋白纤维，再用去离子水洗净丝素蛋白纤维并自然晾干；（2）配制纯丝素蛋白溶液：将步骤（1）得到的丝素蛋白纤维溶于三元溶液或其他溶液中，在75℃下搅拌溶解，离心过滤后，取滤液进行透析，得到纯丝素蛋白溶液，作为水相；所述三元溶液为CaCl2/H2O/CH3CH2OH；所述其他溶液为LiBr，CaCl2，Ca（NO3）2或H3PO4；（3）采用W/O/O复乳法制备微球：在搅拌状态下，将步骤（2）获得的水相缓慢加入油相1乳化一定时间，形成W/O混合相，然后再将W/O混合相加入到油相2再乳化一定时间，形成均一稳定的W/O/O混合相，制备得到丝素蛋白微球；所述油相1选自真空泵油、机油、大豆油、花生油、菜籽油、异辛烷、正己烷、环己烷、二氯甲烷、Span80和Tween-80中的一种或几种混合；所述油相2选自液体石蜡、乙酸乙酯、乙酸丁酯、环己烷、汽油、硅油、玉米油、大豆油、Span80和Tween-80中的一种或几种混合；所述水相：油相1：油相2的体积比为1：1-20:1-20；搅拌转速为200-1000rpm；（4）交联固化成球：向步骤（3）得到的W/O/O混合相中缓慢加入交联剂进行交联，获得微球；所述交联剂为EDC/NHS、京尼平、环氧硅烷、马来酸酐、戊二酸酐、丁二酸酐、戊二醛、聚乙二醇缩水甘油醚、聚丙二醇二缩水甘油醚、氮丙啶中的一种或几种混合；（5）除油洗涤：停止搅拌，静置，除去上层的油乳液，先后用表面活性剂和去离子水反复洗涤步骤（4）获得的微球，抽滤得到丝素蛋白微球；所述表面活性剂为聚氧乙烯壬基酚醚、壬基酚聚氧乙烯醚磷酸单酯、石油醚、TRITON-100、OP-10、SA-2两性表面活本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种细胞培养用SFL微载体的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：（1）蚕茧脱胶：将蚕茧在Na

【技术特征摘要】
1.一种细胞培养用SFL微载体的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：（1）蚕茧脱胶：将蚕茧在Na2CO3溶液中进行脱胶，获得丝素蛋白纤维，再用去离子水洗净丝素蛋白纤维并自然晾干；（2）配制纯丝素蛋白溶液：将步骤（1）得到的丝素蛋白纤维溶于三元溶液或其他溶液中，在75℃下搅拌溶解，离心过滤后，取滤液进行透析，得到纯丝素蛋白溶液，作为水相；所述三元溶液为CaCl2/H2O/CH3CH2OH；所述其他溶液为LiBr，CaCl2，Ca（NO3）2或H3PO4；（3）采用W/O/O复乳法制备微球：在搅拌状态下，将步骤（2）获得的水相缓慢加入油相1乳化一定时间，形成W/O混合相，然后再将W/O混合相加入到油相2再乳化一定时间，形成均一稳定的W/O/O混合相，制备得到丝素蛋白微球；所述油相1选自真空泵油、机油、大豆油、花生油、菜籽油、异辛烷、正己烷、环己烷、二氯甲烷、Span80和Tween-80中的一种或几种混合；所述油相2选自液体石蜡、乙酸乙酯、乙酸丁酯、环己烷、汽油、硅油、玉米油、大豆油、Span80和Tween-80中的一种或几种混合；所述水相：油相1：油相2的体积比为1：1-20:1-20；搅拌转速为200-1000rpm；（4）交联固化成球：向步骤（3）得到的W/O/O混合相中缓慢加入交联剂进行交联，获得微球；所述交联剂为EDC/NHS、京尼平、环氧硅烷、马来酸酐、戊二酸酐、丁二酸酐、戊二醛、聚乙二醇缩水甘油醚、聚丙二醇二缩水甘油醚、氮丙啶中的一种或几种混合；（5）除油洗涤：停止搅拌，静置，除去上层的油乳液，先后用表面活性剂和去离子水反复洗涤步骤（4）获得的微球，抽滤得到丝素蛋白微球；所述表面活性剂为聚氧乙烯壬基酚醚、壬基酚聚氧乙烯醚磷酸单酯、石油醚、TRITON-100、OP-10、SA-2两性表面活性剂、Tween-20、Tween-40、Tween-60、Tween-80中的一种或几种混合；所述表面活性剂溶液的质量百分浓度为0.1-10%；（6）还原脱色：用还原剂中和多余的交联剂；所述还原剂为硼还原剂或甘氨酸；（7）洗涤：去除还原剂溶液，再用去离子水反复洗涤丝素蛋白微球，至上清液呈中性为止，洗涤后筛分选择粒径为100-400μm的微载体，得到细胞培养用SFL微载体。2.根据权...

【专利技术属性】
技术研发人员：李明生，龙仕和，靳冬武，冯玉萍，马忠仁，
申请(专利权)人：西北民族大学，
类型：发明
国别省市：甘肃,62