细胞培养制造技术

本公开内容涉及包含一个或更多个功能化表面的三维[3-D]细胞培养膜的制造，所述功能化表面适于提供适用于分析细胞之增殖、分化或功能的细胞培养条件，所述细胞通常为真核细胞或原核细胞。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】细胞培养介绍本公开内容涉及包含一个或更多个功能化表面的三维[3-D]细胞培养膜的制造，所述功能化表面适于提供适用于分析细胞之增殖、分化或功能的细胞培养条件，所述细胞通常为真核细胞或原核细胞。所述细胞培养膜适用于在现有细胞培养塑料器皿中安装并使用以用于培养细胞，并且还适用于高分辨率显微技术。细胞培养膜的多细胞阵列形式还提供了高效且成本有效的装置来可重复地提供培养物中的细胞，其可用于药物筛选方法。
技术介绍
真核细胞(例如哺乳动物细胞)的培养已成为一种常规方法并且明确限定了使细胞能够增殖、分化和发挥功能的细胞培养条件。通常，哺乳动物细胞的细胞培养需要通常由塑料(典型为聚苯乙烯)制造的无菌容器，限定生长培养基以及在一些实例中的饲养细胞和血清。饲养细胞的作用在于提供刺激细胞增殖和/或维持细胞处于未分化状态并且可影响细胞功能的信号。哺乳动物细胞的培养具有多种应用并且存在使用细胞培养来进行实验和研究的多种体外测定和模型；例如细胞在组织工程中的用途；哺乳动物表达系统用于产生重组蛋白的用途以及哺乳动物细胞在初步药物筛选中的用途。在初步药物筛选中使用哺乳动物细胞以确定先导治疗剂(leadtherapeutic)(例如，小分子激动剂或拮抗剂、单克隆抗体、肽治疗剂、核酸适配体、小抑制性RNA)是否具有效力，然后进行动物试验。需要提供改进的细胞培养系统，可在所述改进的细胞培养系统中培养哺乳动物细胞以提供技术上尽可能接近其天然状态的细胞群体，从而能够以可靠的方式分析细胞增殖、分化和功能。细胞培养系统在本领域是已知的并且技术人员已使用多年。例如，WO2010/005995公开了作为传染病分析平台的微图案(micro-patterned)共培养系统。WO2003/014334公开了体外细胞培养方法，其提供了使得前列腺上皮细胞能够形成与在体内发现的前列腺腺泡非常类似的3D前列腺样腺泡的培养方案。此外，WO00/34454中描述了包含微孔(microcellular)聚合物材料的细胞培养基材(substrate)。这些聚合物形成孔彼此相互连接的网状结构，从而提供细胞可附着至其并增殖的基材。细胞培养通常包括使细胞在封闭的细胞培养容器中于无菌条件下在单层培养物中生长。一种方法是使用2D蛋白质图案或3D微孔(micro-well)。2D蛋白质图案已成功并广泛地用于控制细胞行为。此外，使用硅蚀刻Si晶片[1、2]、玻璃[3]、聚二甲基硅氧烷[PDMS][4]、弹性印章(elastomericstamp)[5]、水凝胶(如琼脂糖或PEG)[6、7]、胶原蛋白[8]或Parylen膜[9]和纤维[10]进行的微孔制造已被用于在受限环境中培养单细胞或有限数目的细胞。然而，该技术通常相当于使用微孔作为小型化培养皿而没有利用细胞在孔中的限制以及产生3D蛋白质涂覆的凹穴(nich)的可能性。这主要是因为这样的事实：至少对单细胞培养而言，化学涂层在孔的侧面、顶部和底部不可能不同，并因此仅可为细胞提供单一化学信号，很少观察到优于2D图案化表面的优点。此外，单细胞微孔技术不太适合于高分辨率成像，原因是其经受由细胞和用于形成微孔的材料之间的率变化(例如硅聚合物的折射率为约1.45)所造成的图像失真[11]。例如而非限制性地，使用原代肝细胞来举例说明本公开内容。我们的3D差异性表面涂层允许培养原代肝细胞作为具有可用于药物代谢分析的受控胆小管[BC]形态的细胞双联体(doublet)。我们的技术使得功能原代肝细胞能够在双联体水平培养至少96小时。此外，我们的技术提供可包括在任意标准细胞培养装置中的通用独立膜。本文公开的细胞培养系统可用于哺乳动物细胞以提供用于产生更接近地反映体内条件的细胞培养物的设备，从而提供应用于例如组织工程、重组蛋白生产和药物筛选的更可靠的细胞培养系统。专利技术陈述根据本专利技术的一个方面，提供了三维细胞培养基材，其包含：包含适于细胞培养之经固化聚合物的穿孔膜，其特征在于所述膜具有至少两个经改性细胞培养表面，其中第一表面包含至少一种细胞培养剂并且第二表面包含第二种不同的细胞培养剂，其中所述膜增强与所述膜相缔合之细胞的增殖和/或分化或功能。在本专利技术的一个优选实施方案中，所述膜包含多个穿孔，其中所述穿孔的直径为至少5μm至1000μm；优选直径为约20μm至300μm。纵横比(aspectratio)通常被认为是外形(feature)的高度与特征性横向尺寸之间的比例关系。在本公开内容的上下文中，关于穿孔尺寸，纵横比通常不大于2。在本专利技术的一个优选实施方案中，所述穿孔的高度为10μm至50μm；优选高度为40μm。在本专利技术的一个优选实施方案中，所述可固化聚合物是可UV固化的。优选地，所述可固化聚合物是基于丙烯酸的聚合物。基于丙烯酸的聚合物在本领域是公知的并且包括例如聚(甲基丙烯酸甲酯)[PMMA]——Norland粘合剂系列的光学粘合剂[NOA系列；参见http：//www.norlandprod.com)。另一些实例包括具有期望光学性能的可固化聚合物，其可获自MyPolymerhttp：//www.mypolymers.com，例如折射率不同的My132、133、136、145、147。在本专利技术的一个优选实施方案中，所述细胞培养剂和/或所述膜通过包含交联剂而进行进一步改性，所述交联剂有助于所述细胞培养剂与所述膜交联，从而提供经改性细胞培养表面。提供经改性细胞培养表面将有助于施加至膜之细胞的生长和分化。根据本专利技术的细胞培养剂通常是蛋白质或糖蛋白。涉及维持细胞之增殖和/或分化的蛋白质是公知的。例如，典型的蛋白质因子包括细胞外基质蛋白，例如纤连蛋白、层粘连蛋白、胶原蛋白、钙粘附蛋白和成纤维细胞生长因子，并且(根据细胞类型)维持细胞增殖和/或分化所需的单核因子和细胞因子也包括在本专利技术的范围内。此外，公知的是，碳水化合物剂(例如凝集素)参与促进细胞分化并在类似和不同细胞类型之间形成细胞与细胞的接触。在本专利技术的一个优选实施方案中，所述膜的折射率为约1.30至约1.50；优选约1.33至约1.45。在本专利技术的一个优选实施方案中，所述细胞基材包含相互连接的细胞培养微孔的网络。在本专利技术的另一个优选实施方案中，所述网络含多个长形的细胞培养微孔，其适于提供至少所述第一经改性细胞培养表面和第二经改性细胞培养表面。优选地，所述长形微孔的长度为至少300μm。优选地，所述长形微孔为至少30μm宽。根据本专利技术的另一个方面，提供了用于微制造包含至少一个细胞培养微孔的细胞培养膜的方法，其中所述微孔调整为有至少两个功能化细胞培养表面，所述方法包括以下步骤：i)使支持物的表面与通过提供一个或更多个凸起的突出部分进行调整的基材相接触，其中所述突出部分中的一个或更多个接触所述支持物的表面；ii)将细胞培养兼容性聚合物溶液施加于所述基材，其中所述聚合物是可固化的；iii)固化所施加的聚合物以形成细胞培养膜；iv)从所述基材中移除所述膜并使第一膜表面与一种或更多种细胞培养剂相接触；v)重新定向所述膜以暴露第二膜表面；并且使所述第二膜表面与第二种不同的细胞培养剂相接触；以及任选地vi)重复iv)和/或v)以进一步功能化所述细胞培养膜。根据本专利技术的基材可以是硅基的，例如聚二甲基硅氧烷[PDMS]本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种三维细胞培养基材，其包含：包含适于细胞培养的固化聚合物的穿孔膜，其特征在于所述膜具有至少两个经改性细胞培养表面，其中第一表面包含至少一种细胞培养剂并且第二表面包含第二种不同的细胞培养剂，其中所述膜增强与所述膜缔合之细胞的增殖和/或分化或功能。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2012.08.01 GB 1213654.51.一种三维细胞培养基材，其包含：包含适于细胞培养的固化聚合物的穿孔膜，其特征在于所述膜具有至少两个经改性细胞培养表面，其中第一表面包含至少一种细胞培养剂并且第二表面包含第二种不同的细胞培养剂，其中所述膜增强与所述膜缔合之细胞的增殖和/或分化或功能。2.根据权利要求1所述的基材，其中所述膜包含多个穿孔，其中所述穿孔的直径为至少5μm至1000μm。3.根据权利要求1或2所述的基材，其中所述穿孔的纵横比不大于2。4.根据权利要求1所述的基材，其中固化聚合物是可UV固化的。5.根据权利要求4所述的基材，其中所述可UV固化的聚合物是基于丙烯酸的聚合物。6.根据权利要求1所述的基材，其中所述细胞培养剂和/或所述膜通过包含交联剂而进行进一步改性，所述交联剂有助于所述细胞培养剂与所述膜交联，从而提供经改性的细胞培养表面。7.根据权利要求1所述的基材，其中所述膜的折射率为约1.30至约1.50。8.根据权利要求1所述的基材，其中所述细胞培养基材包含相互连接之细胞培养微孔的网络。9.根据权利要求8所述的基材，其中所述网络包含多个长形的细胞培养微孔，其适于提供至少所述两个经改性细胞培养表面。10.根据权利要求9所述的基材，其中所述长形的细胞培养微孔的长度为至少300μm。11.根据权利要求10所述的基材，其中所述长形微孔为至少30μm宽。12.一种用于微制造包含至少一个细胞培养微孔的细胞培养膜的方法，其中所述微孔调整为具有至少两个功能化细胞培养表面，所述方法包括以下步骤：i)使支持物的表面与通过设置一个或更多个凸起的突出部分进行调整的基材相接触，其中所述突出部分中的一个或更多个接触所述支持物的表面；ii)将细胞培养兼容性聚合物溶液施加于所述基材，其中所述聚合物是可固化的；iii)固化所施加的聚合物以形成细胞培养膜；iv)从所述基材移出所述膜并使第一膜表面与一种或更多种细胞培养剂相接触；v)重新定向所述膜以暴露第二膜表面；并且使所述第二膜表面与第二种不同的细胞培养剂相接触；以及任选地vi)重复iv)和/或v)以进一步功能化所述细胞培养膜。13.根据权利要求12所述的方法，其中步骤ii)至vi)通过包含化学交联剂来进一步改性，所述化学交联剂有助于所述细胞培养剂与所述细胞培养膜交联。14.根据权利要求13所述的方法，其中所述化学交联剂是异双功能交联剂。15.根据权利要求14所述的方法，其中所述交联剂是α-丙烯酰基-ω-羧基琥珀酰亚胺酯聚(乙二醇)并且包括在权利要求12的步骤ii)中。16.根据权利要求12至15中任一项所述的方法，其中所述细胞培养剂是蛋白质。17.根据权利要求12至15中任一项所述的方法，其中所述细胞培养剂是碳水化合物。18.根据权利要求12至15中任一项所述的方法，其中所述细胞培养剂是脂质。19.根据权利要求12至15中任一项所述的方法，其中细胞培养剂包含聚氨基酸涂层。20.根据权利要求12至15中任一项所述的方法，其中所述细胞培养剂是防污剂。21.一种细胞培养膜，其通过根据权利要求12至20中任一项所述的方法获得或能够通过其获得。22.一种细胞培养容器，其包含根据权利要求1至11中任一...

【专利技术属性】
技术研发人员：维尔日勒·尼古拉斯·罗伯特·维亚诺夫，李秋实，
申请(专利权)人：新加坡国立大学，国家科学研究中心，
类型：发明
国别省市：新加坡;SG