本发明专利技术公开了一种CHO-S细胞半固体培养基及其配制方法与应用。按重量百分比计，所述半固体培养基包含如下组分：2.46％～2.48％CD FortiCHO培养基，2％～3％甲基纤维素。该CHO-S细胞半固体培养基由2×CD FortiCHO和2×甲基纤维素溶液按照体积比1:1充分混匀后离心除去肉眼不可见颗粒，收集上层离心液得到。本发明专利技术的CHO-S细胞半固体培养基可用于替代进口CHO-S细胞半固体培养基培养CHO-S细胞，细胞生长大，蛋白表达量高，生长状态好，可大幅降低研发生产成本。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种适合CHO-S细胞生长的半固体培养基及其配制方法与应用，属于CHO-S细胞株开发领域。
技术介绍
抗体的靶向特异性及高表达量在临床中具有重要意义，因此如何比竞争对手更快一步寻找到能够稳定并大量分泌正确抗体的细胞系就显得尤为重要。对此，传统的细胞筛选采用有限稀释法或细胞分选法，工作量大耗时长，通常筛选1000个细胞需要8周，而最终才能获得一个好的克隆；且在挑克隆的时候容易对细胞造成机械伤害，导致克隆的成活率下降。现在企业常使用半固体培基法进行单克隆筛选。细胞生长在半固体培养基中，形成单克隆细胞团，同时将抗体分泌在细胞团周围，半固体培养基中含有荧光标记的二抗，能与抗体Fc片段特异性结合，当用一定波长的光进行激发时就能发出荧光。使用图像分析软件能够对单克隆细胞团的大小、荧光强度进行测定，从而筛选出生长旺盛、表达量高的单克隆细胞团。Molecular Device公司开发的Clone Pix system筛选方法(参考《CHO细胞株开发技术策略探讨》)有效地避免了人工筛选细胞的弊端，可在短时间内挑选大量克隆，基于荧光检测技术但无需表达载体自身产生荧光，从而有效地避免了假阳性；细胞处于半固体培养基中，挑选过程柔和，增加了细胞的存活率，因此效率大大提高。在CHO细胞克隆筛选中，以Clone Pix system筛选方法为例，适合CHO细胞生长的半固体培养基是其中最关键环节之一。Molicular Devices公司开发了适合各种细胞生长的半固体培养基，其中适合CHO-S细胞的半固体培养基CloneMedia-CHO-G(Cat：K8740)价格非常昂贵，90mL售价4251元，货期长，物流成本高，且少有此款产品的替代品，因此有关CHO-S细胞开发的研发成本非常高。除了固定成分外，半固体培养基的配制方法也对细胞生长起重要作用。而CloneMedia-CHO-G半固体培养基的配方和配制方法均为Molicular Devices的商业秘密，不为公众所知。因此，有必要开发新的适合CHO-S细胞生长的半固体培养基及其制备方法，以
降低科研成本，增大实验材料的选择自由度。
技术实现思路
为解决上述问题，本专利技术的一个目的是提供一种CHO-S细胞半固体培养基，该半固体培养基适合于CHO-S细胞生长，可用于细胞克隆筛选阶段，能有效替代Molicular Devices公司开发的适合CHO-S细胞的CloneMedia-CHO-G半固体培养基。本专利技术的另一个目的是提供一种配制适合CHO-S细胞半固体培养基的方法。为解决上述问题，本专利技术的技术方案为：一方面，本专利技术提供一种CHO-S细胞半固体培养基，按重量百分比计，所述半固体培养基包含如下组分：2.46％～2.48％CD FortiCHO培养基，2％～3％甲基纤维素。根据本专利技术的具体实施方案，本专利技术的CHO-S细胞半固体培养基由2×CDFortiCHO和2×甲基纤维素溶液按照体积比1:1充分混匀后离心除去肉眼不可见颗粒，收集上层离心液得到。优选地，上述CD FortiCHO培养基为固体培养基CD FortiCHO AGT Medium Prototype或CD FortiCHO II，这些固体培养基可由gibco公司商购获得。优选地，按质量体积比计算，所述甲基纤维素在20℃下、2％时的黏度为25cps～1500cps。在本专利技术的一种实施方式中，所述甲基纤维素的平均分子量为17000～63000。优选地，所述甲基纤维素的含量为2.7％～3.0％。另一方面，本专利技术还提供了一种配制所述CHO-S细胞半固体培养基的方法，该方法包括：a、将体积比为1:1的2×CD FortiCHO培养基和2×甲基纤维素溶液充分混匀；b、离心除去肉眼不可见颗粒物质，收集上层离心液，即得CHO-S细胞半固体培养基；其中，优选地，所述离心条件为4000rpm～10000rpm，离心30min以上。根据本专利技术的具体实施方案，本专利技术中，所述2×CD FortiCHO培养基是按照以下方法制得的：称量CD FortiCHO培养基，加入超纯水，充分搅拌溶解，0.20μM滤膜过滤除菌得到2×CD FortiCHO培养基。根据本专利技术的具体实施方案，本专利技术中，所述2×甲基纤维素溶液是按照以下方法制得的：称量甲基纤维素，加入超纯水，充分搅拌溶解，高压灭菌得到2×甲基纤
维素溶液。高压灭菌条件可为常规培养基灭菌条件，例如可为121℃左右高压灭菌30min。半固体培养基的配制方法通常通过肉眼观察培养基澄清透亮且无固体颗粒物即判断为搅拌均匀、各组分充分溶解。一般通过延长搅拌时间或加大搅拌力度或通过煮沸等方式保证半固体培养基各组分充分溶解。但通过上述本领域常规方法配制的半固体培养基在实际应用中效果并非最佳，应用效果低于商品化半固体培养基。而在教科书的教导下，本领域普通技术人员通常认为半固体培养基充分搅拌溶解，肉眼观察澄清即可，更不会进一步探究其微观形态对应用效果的影响，也未就此检索到相关的科技文献或专利文献报道。本案专利技术人偶然将上述半固体培养基置于光学显微镜下观察发现，肉眼观察无固体颗粒的半固体培养基中仍存在大量细小难溶的固体颗粒物。进一步研究发现，离心可除去这些固体颗粒物，并将离心后的CHO-S细胞半固体培养基用于CHO-S细胞培养。试验结果表明：离心处理的半固体培养基与未做离心处理的半固体培养基相比，CHO-S细胞生长大，蛋白表达量高，生长状态相对较好，有益于后续细胞筛选工作。离心处理后的CHO-S细胞半固体培养基用于培养CHO-S细胞，获得了预料不到的技术效果，超出了本领域技术人员的预期。所述离心条件的判断标准为在光学显微镜下观察所述半固体培养基无细小固体颗粒物(即，在光学显微镜下观察无可见的固体颗粒物)。优选地，本专利技术推荐离心条件为4000rpm～10000rpm，离心30min以上。本领域技术人员可以根据具体实验条件、离心机转子大小选择更具体的转速和离心时间。优选地，离心操作最好是在低温下进行，比如4℃低温离心。特别是含有CD FortiCHO培养基的离心操作尽量4℃低温操作。另一方面，本专利技术还提供了所述CHO-S细胞半固体培养基在培养CHO-S细胞中的应用。具体应用时，培养CHO-S细胞时的培养条件为：5％CO2，36.5℃。优选地，是静止培养箱培养或120rpm摇瓶培养。试验结果表明：本专利技术的CHO-S细胞半固体培养基用于培养CHO-S细胞，CHO-S细胞生长大，蛋白表达量高，生长状态相对较好，有益于后续细胞筛选工作。本专利技术的有益效果：本专利技术提供的CHO-S细胞半固体培养基适合CHO-S细胞生长，能够用于细胞克
隆筛选阶段，为科研工作者或企业提供更多选择；可用于替代Molicular Devices公司的CHO-S细胞半固体培养基CloneMedia-CHO-G，进而降低进口产品过长的供货期对科研工作的影响，降低企业对该产品的依赖性；90mL CloneMedia-CHO-G的售价为4251元人民币，而配制相同体积的本专利技术所述半固体培养基的成本约为130元人民币，因此，采用本专利技术所述的半固体培养基替代Molicular Devices公司的CHO-S细胞半固体培养基Clon本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种CHO‑S细胞半固体培养基，按重量百分比计，所述半固体培养基包含如下组分：2.46％～2.48％CD FortiCHO培养基，2％～3％甲基纤维素。
【技术特征摘要】
1.一种CHO-S细胞半固体培养基，按重量百分比计，所述半固体培养基包含如下组分：2.46％～2.48％CD FortiCHO培养基，2％～3％甲基纤维素。2.根据权利要求1所述的CHO-S细胞半固体培养基，所述CHO-S细胞半固体培养基由2×CD FortiCHO和2×甲基纤维素溶液按照体积比1:1充分混匀后离心除去肉眼不可见颗粒，收集上层离心液得到。3.根据权利要求1或2所述的CHO-S细胞半固体培养基，其中，所述CD FortiCHO培养基为固体培养基CD FortiCHO AGT Medium Prototype或CD FortiCHO II。4.根据权利要求1所述的CHO-S细胞半固体培养基，其中，按质量体积比计算，所述甲基纤维素在20℃下、2％时的黏度为25cps～1500cps。5.根据权利要求1所述的CHO-S细胞半固体培养基，其中，所述甲基纤维素的平均分子量为17000～63000。6.根据权利要求1所述的CHO-S细胞半固体培养基，其中，所述甲...
【专利技术属性】
技术研发人员：陶维红，秦民民，张哲如，
申请(专利权)人：上海津曼特生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31
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