本公开涉及一种富集有生物活性因子的条件培养基(CM)、其组合物以及生产该CM的方法。获得在条件培养基中所需量的生物活性因子的方法，包括汇集骨髓来源的间充质基质/干细胞、培养所汇集的细胞和使所述细胞培养物在指定融汇度下经受细胞饲养进度和在特定传代/时间段收集富有生物活性因子的有效条件培养基。该方法的进一步目的在于最大化生成条件培养基的概率，该条件培养基具有降低的生物可变性并且包含大量具有特定生物功能/性质的生物活性因子。本公开还涉及所述条件培养基的组合物和制剂以及它们在化妆品和治疗领域中的用途。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本公开涉及一种从汇集的骨髓源性间充质干细胞(BM MSC)获得富有生物活性因 子的条件培养基(CM)的方法。本方法通过使用汇集自多个供体的细胞(其将由来自个别供 体的细胞分泌所述生长因子和细胞因子的水平的固有可变性(variability)标准化)并且 通过提供在指定融汇度(confIuency)下的细胞饲养进度(细胞饲养时间表，cell feeding schedule)，确保了所需生长因子和细胞因子的较高产量。本公开进一步涉及用于在化妆品 领域和治疗领域中应用的条件培养基的制剂(formulation)。
技术介绍
由于包括皮肤条理和伤口愈合的各种迹象，间充质干细胞在治疗/化妆品领域已 经获得了极大兴趣。MSC参与组织修复的机理主要是通过营养因子的分泌。MSC通过它们的 分泌组(分泌蛋白质组，secretome)分泌广泛的生长因子、细胞因子和趋化因子从而提供所 需的微环境。MSC分泌组在再生医学以及还有在化妆品应用中提供了治疗方式的新途径。生 长因子、细胞因子和趋化因子充当细胞通讯的工具，并且这些分子可以从条件培养基(CM) 或收获自培养细胞的用过的培养基中找到（Shohara et al.，2012)。最近，使用CM代替各种 基于细胞的疗法进行了许多临床前研究(Walter et al.，2010)。所有这些研究均为分泌组 领域给予了巨大的希望。 另外，从骨髓源性间充质干细胞、人胚胎干细胞、羊膜来源的多潜能细胞(amnion derived multi potent cells)等获得富有细胞因子和生长因子的条件培养基的方法以及 所述条件培养基在涉及伤口愈合、毛发生长、疤痕减少和其他皮肤病的治疗应用中的用途 在本领域中是已知的。然而，存在对生产条件培养基的需求，该条件培养基含有所需类型和 量的用于特定治疗应用的细胞因子/生长因子，该特定治疗应用需要最佳数量的特定细胞 因子/生长因子或细胞因子/生长因子的特定组合。因此，本公开的目的在于解决本领域当 前缺乏的此类需求。
技术实现思路
因此，本公开涉及一种制备包含由间充质基质细胞分泌的生物活性因子 (bioactive factor)的条件培养基（conditioned medium)的方法，所述方法包含以下操 作:a.在细胞培养基中培养所述间充质细胞，随后扩增并且收获所述细胞;和b.使所收获的 细胞经受下列过程:a.补料分批活化(分批补料式活化，f ed batch act i vat ion); b.补料分 批活化之后完全培养基更换(complete medium change);或c.完全培养基更换;或它们的 任何组合，从而获得所述条件培养基;本公开还涉及一种制备包含由间充质细胞分泌的生 物活性因子的条件培养基的方法，所述方法包含以下操作:a.在细胞培养基中培养所述间 充质细胞，随后扩增并且收获所述细胞;和b.使所收获的细胞经受补料分批活化随后完全 培养基更换的过程，以获得所述条件培养基;本公开还涉及一种条件培养基，其包含由间充 质细胞分泌的生物活性因子;本公开还涉及一种组合物，其包含条件培养基与药学上可接 受的赋形剂和添加剂;本专利技术还涉及一种处理(管理，manage)皮肤相关状况的方法，所述方 法包括向有此需求的受试者给予所述条件培养基或其制剂(formulation)的操作。【附图说明】 为了使本公开能够被容易地理解和付诸实践，现在将参考参照附图阐明的示例性 实施方式。附图连同以下详细说明被并入本说明书并且构成本说明书的一部分，并且用来 进一步阐明实施方式和解释根据本公开所述的各种原理和优点，其中： 图1显示了三个供体之间VEGF分泌的变化及其在汇集和培养之后的标准化（归一 化、正常化，normalization) 〇 图2显示了由汇集的骨髓源性间充质基质/干细胞在条件培养基中各种细胞因子 和生长因子的表达水平，超过以及高于细胞培养基。将使用ELISA和Luminexd?基检测的 多重分析(multiplex analysis)用于所述评价。 图3显示了由通过3种不同的过程培养的多能间充质基质/干细胞分泌的生物活性 的比较。（a)VEGF; (b)PGE 2; (C)TGFK和（d)促血管新生蛋白因子_1(血管生成素， Angiopoietin-I)〇 图4显示了由三种不同批次通过过程2生成的条件培养基中（a)VEGF、（b)TGFm和 (c)PGE-2的水平。 图5(a)显示了在通过使用分子截留（molecular cut-off)>3kDa和MkDa的TFF技 术浓缩后，由VEGF的水平显示的条件培养基中增强的生物活性因子保留；（b)显示了使用人 脐静脉内皮细胞通过透孔迀移试验(transwell migration assay)的VEGF功能性。图6显示了CM对使用叔丁基过氧化氢（tbOH)处理的人包皮成纤维细胞(HFF)的抗 老化效果。（a)显示了在使用IOX CM以5 %、10 %和50 %剂量处理的tbOH损伤的细胞中的胶 原修复(恢复，restoration); (b)显示了与相应的10X对照培养基相比，使用10X CM以10 % 和50 %剂量处理的tbOH损伤的HFF-I细胞中弹性蛋白水平的恢复；（c)显示了与它们相应的 IOX对照培养基相比，使用IOX CM以5 %和10 %剂量处理的tbOH损伤的HFF-1细胞中透明质 酸(HA)水平的恢复；（d)显示了与它们相应的10X对照培养基相比，使用10X CM以5%和50% 剂量处理的tbOH损伤的HFF-I细胞中细胞周期蛋白（eye I in) Bl水平的提高。图7显示了在真皮成纤维细胞中，10X CM预处理针对由氧化损伤导致的胶原降解 的保护效果的评价。 图8涉及图表，其描绘了HFF细胞在5个稀释度的条件培养基中的增殖潜能与在对 照培养基中的增殖潜能的比较分析。 图9a显示了显著的成纤维细胞迀移，其指示使用10X CM处理HFF-I细胞后的积极 的(有利的，pos it ive)皮肤再生(更新，renewal)效果。图9b显示了 10X对照和10X CM对HFF-I细胞迀移的影响，其指示积极的皮肤再生效 果。数据点被表示为三次重复的值的平均值土标准误差。 图10显示了在人真皮成纤维细胞中，10X CM针对由叔丁基过氧化氢引起的氧化应 激的细胞保护/活力恢复效果。数据点表示为三次重复的值的平均值±标准误差。 图11显示了与它们相应的对照培养基相比，CM对人包皮成纤维细胞(HFF-1细胞） 的防皱纹效果，所述人包皮成纤维细胞(HFF-1细胞)经受了UV辐射并且使用IOX CM以10% 和50%剂量处理。（a)显示了弹性蛋白水平的恢复；（b)显示了胱天蛋白酶3(caspaSe 3)活 化的降低；（c)显示了防护DNA损伤的程度。 图12显示了在真皮成纤维细胞中，IOX CM针对氧化应激诱导凋亡的抗凋亡作用的 评价。 图13显示了平均皮肤水分测试仪(corneometer)读数的图形表示，指示了使用所 用制剂的皮肤保湿(皮肤水合，skin hydration)水平。 图14显示了平均血红素测试仪(mexameter)读数的图形表示，指示了使用所有本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种制备条件培养基的方法，所述条件培养基包含由间充质基质细胞分泌的生物活性因子，所述方法包括以下操作：a.在细胞培养基中培养间充质细胞，随后扩增并收获所述细胞；和b.使所收获的细胞经受下列过程：a.补料分批活化；b.补料分批活化随后完全培养基更换；或c.完全培养基更换；或它们的任何组合，从而获得所述条件培养基。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：苏达·巴拉苏布拉马尼安，斯瓦蒂·孙达尔拉杰，查兰·泰伊，拉梅什·拉姆钱德拉蓬德，拉维拉加·尼拉瓦尔塞塔拉姆，阿尼什·森马宗达，
申请(专利权)人：斯蒂姆普优提克斯个人研究有限公司，
类型：发明
国别省市：印度;IN
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