用于鉴定并调整多核苷酸样品测序中的偏差的方法和试剂盒技术

本发明专利技术公开了用于测定多核苷酸样品的一个以上核苷酸位置处的一种以上核苷酸的方法，所述多核苷酸样品包括在核苷酸位置处具有不同核苷酸的不均一多核苷酸。所公开的方法可被用于控制多核苷酸样品的测序期间的测序偏差。合适的样品可包括在患者的诊断、预后和治疗中使用的患者样品。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利说明】用于鉴定并调整多核苷酸样品测序中的偏差的方法和试剂盒
技术介绍
本专利技术的领域涉及用于对多核苷酸样品进行测序的方法。具体地，本专利技术的领域 涉及用于鉴定在多核苷酸样品的测序中的偏差的方法。所述方法可以被修改以鉴定和调整 用于患有疾病或障碍的患者的诊断、预后和治疗的测序方法中的偏差。 在过去的三十年中，基因突变和表观遗传修饰的检测成为医学中重要的临床工 具。突变和表观遗传变化，例如甲基化，已经使用利用了限制性内切酶(例如甲基化特异性 数字核型分析(MSDK)和组合亚硫酸氢盐限制性分析(COBRA))、聚合酶链反应(PCR)(例如甲 基化特异性PCR(MSP)、重甲基PCR和甲基轻PCR)、杂交(例如表-微阵列和微球阵列）和DNA测 序(例如克隆(pyro/Sanger)测序、或合成型测序）的方法进行检测。特别地，DNA测序技术中 降低了 DNA测序成本的进步允许对疾病的遗传学和表观遗传学进行广泛研究。 然而，由于各种挑战，使用富集测序的基因组范围的测序仅主要在研究背景下进 行，尚未适合于临床诊断。例如，基因组范围的亚硫酸氢盐测序(BSS)的一些挑战包括临床 样品高度不同并含有具有不同程度的甲基化的等位基因的事实。为了以足够程度的灵敏度 和特异性检测给定位置处的甲基化(或给定位置处的甲基化的缺乏），要求相对较大的样本 大小。因此，使用相对小的样本大小的改善表观遗传修饰和基因突变的检测的灵敏度和特 异性的新的DNA测序方法是合乎需要的。特别地，这些新的DNA测序方法应该解决利用基因 组范围的测序作为临床诊断中的工具的挑战。
技术实现思路
本专利技术公开了用于测定多核苷酸样品的核苷酸位置处的核苷酸的方法，其中多核 苷酸样品包括在核苷酸位置处具有不同核苷酸的不均一多核苷酸。所述方法可被用于鉴定 不均一多核苷酸的核苷酸位置处多种不同核苷酸的存在。 所述方法可以包括：（a)对跨越所述核苷酸位置的多核苷酸样品的目标区域进行 测序;和(b)对多核苷酸片段组进行测序，其中所述多核苷酸片段包括：（i)对应于多核苷酸 样品的目标区域的多核苷酸序列；和（ii)用于区分多核苷酸片段和目标区域的标签，其可 包括核苷酸标签。多核苷酸片段组通常包括在多核苷酸样品的核苷酸位置处具有不同核苷 酸的两种以上不同的多核苷酸片段。 在所述方法中，目标区域和多核苷酸片段组可以在相同或不同的反应混合物中被 测序。用于对目标区域和多核苷酸片段组进行测序的反应混合物可以包括特异性杂交到目 标区域的一个以上引物和特异性杂交到多核苷酸片段组的一个以上引物。例如，特异性杂 交到多核苷酸片段组的引物可包括特异性杂交到存在于多核苷酸片段组中的核苷酸标签 的序列。 所述方法可包括进行深度测序。在一些实施方式中，所述方法可包括确定检测不 均一多核苷酸的核苷酸位置处的核苷酸所需要的测序深度。在其他实施方式中，所述方法 可包括确定不均一多核苷酸的核苷酸位置处的不同核苷酸的测序偏差。 在所述方法中使用的多核苷酸片段组通常包括在多核苷酸样品的核苷酸位置处 具有不同核苷酸的两种以上不同的多核苷酸片段。在一些实施方式中，多核苷酸片段组包 括在多核苷酸样品的核苷酸位置处具有胞嘧啶或胸腺嘧啶的两种以上不同的多核苷酸片 段。例如，多核苷酸片段组可包括除了在待测核苷酸位置外具有相同的核苷酸序列的两种 不同的多核苷酸片段或由其组成，所述两种不同的多核苷酸片段在一种核苷酸片段中的核 苷酸位置处是胞嘧啶，而在另一种核苷酸片段中的核苷酸位置处是胸苷。在一些实施方式 中，多核苷酸片段组可包括等摩尔量的在多核苷酸样品的核苷酸位置处具有胞嘧啶或胸腺 嘧啶的两种不同的多核苷酸片段。所述方法可包括对包括等摩尔量的在多核苷酸样品的核 苷酸位置处具有胞嘧啶或胸腺嘧啶的两种不同的多核苷酸片段的多核苷酸片段组进行测 序，和测定在多核苷酸样品的核苷酸位置处胞嘧啶或胸腺嘧啶的错误发现率。在所述方法中使用的多核苷酸片段组可包括在多核苷酸样品的核苷酸位置处分 别具有腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶或胸腺嘧啶的四种以上不同的多核苷酸片段。例如，多核苷 酸片段组可包括除了在待测核苷酸位置处外具有相同核苷酸序列的四种不同的多核苷酸 片段或由其组成，所述四种不同的多核苷酸片段为:在一种核苷酸片段中的核苷酸位置处 的腺嘌呤;在另一种核苷酸片段中的核苷酸位置处的鸟嘌呤;在另一种核苷酸片段中的核 苷酸位置处的胞嘧啶;和在另一种核苷酸片段中的核苷酸位置处的胸苷。在一些实施方式 中，多核苷酸片段组可包括等摩尔量的在多核苷酸样品的核苷酸位置处分别具有腺嘌呤、 鸟嘌呤、胞嘧啶或胸腺嘧啶的四种不同的多核苷酸片段。所述方法可包括对包括等摩尔量 的在多核苷酸样品的核苷酸位置处分别具有腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶或胸腺嘧啶的四种不 同的多核苷酸片段的多核苷酸片段组进行测序，和测定在多核苷酸样品的核苷酸位置处腺 嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶或胸腺嘧啶的错误发现率。所公开的方法可使用任何来源的核酸，其可包括DNA和RNA。在一些实施方式中，多 核苷酸样品包括基因组DNA。在进一步的实施方式中，基因组DNA在测序之前用选择性修饰 DNA中非甲基化的胞嘧啶残基以生成可检测的修饰的残基但不修饰甲基化的胞嘧啶残基的 试剂处理。在更进一步的实施方式中，在多核苷酸样品的核苷酸位置处的核苷酸是甲基化 的胞嘧啶或修饰的残基，并且多核苷酸片段组包括在多核苷酸样品的核苷酸位置处具有胞 嘧啶或胸腺嘧啶的两种以上不同的多核苷酸片段。所述方法可包括计算（1)在核苷酸位置 处具有甲基化的胞嘧啶的多核苷酸样品的不均一多核苷酸的数量与(2)在核苷酸位置具有 非甲基化的胞嘧啶的多核苷酸样品的不均一多核苷酸的数量的比例。 所述方法通常包括对跨越待测核苷酸位置的多核苷酸样品的目标区域进行测序。 在一些实施方式中，目标区域包括在核苷酸位置5 '的多核苷酸样品的至少约10个核苷酸， 和/或目标区域包括在核苷酸位置3'的多核苷酸样品的至少约10个核苷酸。在其他实施方 式中，目标区域包括在核苷酸位置5 '的多核苷酸样品的至少约20、30、40、50或更多个核苷 酸，和/或目标区域包括在核苷酸位置3 '的多核苷酸样品的至少约20、30、40、50或更多个核 苷酸。因此，目标区域可包括至少约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100或更多个核苷酸。 多核苷酸片段组的多核苷酸片段通常包括：（i)对应于多核苷酸样品的目标区域 的多核苷酸序列;和（ii)用于区分多核苷酸片段和目标区域的标签，例如核苷酸标签。在一 些实施方式中，核苷酸标签包括不存在于多核苷酸样品的目标区域中的至少约2、3、4或5个 核苷酸的核苷酸序列。例如，核苷酸标签例如在执行DNA测序后或在执行DNA测序时（例如， 通过使用特异性杂交到包含核苷酸标签的多核苷酸的引物和/或探针)可被用于区分目标 序列和多核苷酸片段。 所述方法进一步可被用于测定在多核苷酸样品的两个以上不同的核苷酸位置处 的两种以上核苷酸。在一些实施方式中，所述方法可以包括：（a)对跨越所述两个以上核苷 酸位置的多核苷酸样品的目标区域进行测序;和(b)对多核苷酸片段组进行测序，其中所述 多核苷酸片段包括：（i)对应于多核苷酸样品的目标区域的多核苷酸序列;和（ii)本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于测定多核苷酸样品的核苷酸位置处的核苷酸的方法，所述多核苷酸样品包括在核苷酸位置处具有不同的核苷酸的不均一多核苷酸，所述方法包括：(a)对跨越核苷酸位置的多核苷酸样品的目标区域进行测序；和(b)对多核苷酸片段组进行测序，所述多核苷酸片段包括对应于多核苷酸样品的目标区域的多核苷酸序列，所述多核苷酸片段还包括用于区分多核苷酸片段和目标区域的核苷酸标签，并且所述多核苷酸片段组包括在多核苷酸样品的核苷酸位置处具有不同核苷酸的两种以上不同的多核苷酸片段。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：维姆·万克里金格，
申请(专利权)人：莫德科斯健康股份公司，
类型：发明
国别省市：比利时;BE