一种番茄Mi-1基因和ty-5基因的多重PCR检测方法技术

本发明专利技术公开了一种番茄Mi-1基因和ty-5基因的多重PCR检测方法，其包括：1)从番茄叶中提取待检测番茄叶片DNA；2)以上述番茄叶片提取获得的DNA为模板，利用Mi-1和ty-5的引物，通过建立的多重PCR反应体系，对待测样品进行多重PCR扩增；3)PCR产物酶切及电泳检测；4)对待测番茄样品中是否含有Mi-1基因和ty-5基因进行鉴定等步骤。本发明专利技术用于快速鉴定番茄材料中是否含有根结线虫抗病基因Mi-1和番茄黄化曲叶病抗性基因ty-5。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物检测
，具体涉及一种番茄M1-ι基因和ty-5基因的多重PCR检测方法。
技术介绍
番茄是一种重要的蔬菜作物，为蔬菜经济的发展和农民增收做出了巨大的贡献。然而在番茄驯化的过程中，很多的抗性基因都没有被转入栽培番茄中，大量的抗病基因仍然分布在野生番茄中。选育抗多种病害的番茄品种成为了保障番茄产业发展的重要目标。番茄根结线虫病是一种土传性的病害，由于设施面积的逐年扩大，连作重茬问题难以解决，加上根结线虫寄主范围广泛的特点，使得该病对番茄生产的危害逐渐增大。通过胚挽救的方法，将秘鲁番茄中的根结线虫抗性基因M1-Ι导入到栽培番茄中，极大的改善了番茄对根结线虫的抗性。通过基因定位，番茄6号染色体短臂端，CAPS标记REX-1与该基因连锁。番前黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl virus，TYLCV)病是近年来传入我国并大面积爆发的一种番茄病害，发生之初对番茄生产造成了巨大的危害，该病毒主要通过携带TYLCV的烟粉虱进行传播。发生之初，我国的番茄品种中均无抗原，之后通过对国外抗原材料的引进、筛选和鉴定，选育获得了适合我国栽培环境的抗TYLCV品种。目前栽培品种中的抗原基因主要为Ty-l、Ty-2和Ty-3，但是长期使用这些基因存在抗性被变异病毒突破的风险。ty-5基因是目前新发现的抗TYLCV基因，该基因与SLNACI具有连锁关系。目前选育同时含有抗根结线虫和TYLCV的番茄品种对于番茄生产具有重要的意义。在选育的过程中利用分子标记辅助选择的手段可以加速育种的进程。但对于不同的基因分别进行鉴定，费时、费力，成本也很高。在多抗基因聚合育种的过程中，如果可以将根结线虫和TYLCV抗性基因的分子鉴定整合成多重PCR体系，可以极大的提高育种的效率，降低检测过程的成本。但在对现有两个基因的标记进行分析，多态性片段由于存在条带间大小相近，多态性重叠，不利于设计多重PCR体系。
技术实现思路
为克服现有技术的缺陷，本专利技术的目的在于提供一种番茄M1-Ι基因和ty-5基因的多重PCR检测方法，用于快速鉴定番茄材料中是否含有根结线虫抗病基因M1-Ι和番茄黄化曲叶病抗性基因ty-5。为实现上述目的，本专利技术所采用的技术方案如下:—种番前M1-Ι基因和ty-5基因的多重PCR检测方法，其包括以下步骤:1)从番茄叶中提取待检测番茄叶片DNA;2)以上述番茄叶片提取获得的DNA为模板，利用M1-ι和ty-5的引物，通过建立的多重PCR反应体系，对待测样品进行多重PCR扩增；3)PCR产物酶切及电泳检测；4)对待测番茄样品中是否含有M1-1基因和ty-5基因进行鉴定。进一步的方案，本专利技术所述的步骤1)中的番茄叶取自育种、野生、分离群体番茄品种的番茄叶。进一步的方案，本专利技术所述的步骤2)中，ty-5 引物为:NAC1-new F:TTGGATCTGTTCCGCCATGNAC1-new R:TTCCTGCTGCTCGGTTCG；M1-1 引物为:REX-1-new F TCGGAGCCTTGGTCTGAATTREX-1-new R GCCAGAGATGATTCGTGAGA。进一步的方案，本专利技术所述的步骤2)中，多重PCR反应体系为:lOng/μΙ模板DNA 2yL,4pmmol/L NAC1-newR/F各0.8yL，4pmmol/L REX-1R/F各0.5yL，mix 酶 10yL，双蒸水或三蒸水加至20yL;多重PCR反应条件为:94°C预变性3min;每个循环94°C变性45sec，54°C退火45sec，72°C延伸45sec，共38个循环，最后72°C延伸lOmin。进一步的方案，本专利技术所述的步骤3)中，PCR产物酶切过程是在上述扩增产物中加入Taq I酶和Buffer进行酶切。进一步的方案，本专利技术所述的步骤3)电泳采用2%的琼脂糖胶，电泳的具体步骤如下:a)制备2%琼脂糖凝胶:称取琼脂糖置于锥形瓶中，加入1XTAE，微波炉加热煮沸至琼脂糖全部融化，摇匀，冷却到65°C左右，加入核酸染色剂； b)胶板制备::取电泳槽内的有机玻璃内槽洗干净，晾干，放入制胶玻璃板，取透明胶带将玻璃板与内槽两端边缘封好，形成模子;将内槽置于水平位置并在固定位置放好梳子将琼脂糖凝胶液混匀小心地倒入内槽玻璃板上，使胶液缓慢展开，直到整个玻璃板表面形成均匀胶层;室温下静置直至凝胶完全凝固；垂直轻拔梳子，取下胶带，将凝胶及内槽放入电泳槽中；添加1 XTAE电泳缓冲液至没过胶板1-2_为止；c)加样:分别将2yL样品加入胶板的样品小槽内；d)电泳:加样后的凝胶板立即通电进行电泳，电压60-100V，电泳45min ；e)观察照相:采用凝胶成像系统观察并拍照保存。进一步的方案，本专利技术所述的步骤4)对待测样品中M1-Ι基因和ty-5基因进行鉴定方法具体步骤为:在步骤3)酶切后的多态性条带中大找出260bp和206bp条带，即分别对应M1-Ι基因和ty-5基因。相比现有技术，本专利技术的有益效果在于:1.本专利技术所述番茄M1-1基因和ty-5基因的多重PCR检测方法中，PCR体系采用扩增ty-5基因的标记NAC1-new，与SLNACI相比，酶切位点减少，反应体系稳定性更高；2.本专利技术中所述番茄M1-Ι基因和ty-5基因的多重PCR检测方法建立多重PCR反应体系时，采用的扩增M1-Ι基因的标记REX-1-new，与REX-1相比不会与NAC1-new扩增标记重叠，可用于建立多重PCR扩增体系；3.本专利技术所述的番茄M1-Ι基因和ty-5基因的多重PCR检测方法，同时检测ty-5和M1-Ι体系的建立，加快了对分子标记辅助选择的进程，缩短了育种实践，降低了育种成本。【附图说明】图1为ty-5基因和M1-Ι基因检测电泳图谱；其中M:100bp Marker; 1、2、3分别代表SLNAC1-new以 1227、moneymaker和F1 (1227 Xmoneymaker)为模板扩增结果;4、5、6分别代表REX-1-new 以 VFN、moneymaker 和FI (VFNX moneymaker)为模板扩增结果；7 代表多重 PCR 体系以FI (1227 X VFN)为模板扩增结果； 图2为F2(1227XVFN)分离后代多重PCR检测电泳图谱;其中M:100bp Marker； 1-20代表20株随机的F2(1227X VFN)分离单株经多重PCR扩增后电泳结果。【具体实施方式】下面结合具体的实施方式对本专利技术作进一步详细说明。本专利技术所述的番前M1-Ι基因和ty-5基因的多重PCR检测方法，其包括以下步骤:1)从番茄叶中提取待检测番茄叶片DNA;2)以上述番茄叶片提取获得的DNA为模板，利用M1-1和ty-5的引物，通过建立的多重PCR反应体系，对待测样品进行多重PCR扩增；3)PCR产物酶切及电泳检测；4)对待测番茄样品中是否含有M1-1基因和ty-5基因进行鉴定。进一步的方案，本专利技术所述的步骤1)中的番茄叶取自育种、野生、分离群体番茄品种的番茄叶。进一步的方案，本专利技术所述的步骤2)中，ty-5 引物为:NAC1-new F:TTGGATCTGTTCCGCCATGNAC1-new R:TTCCTGCTGCTC本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种番茄Mi‑1基因和ty‑5基因的多重PCR检测方法，其特征在于，其包括以下步骤：1)从番茄叶中提取待检测番茄叶片DNA；2)以上述番茄叶片提取获得的DNA为模板，利用Mi‑1和ty‑5的引物，通过建立的多重PCR反应体系，对待测样品进行多重PCR扩增；3)PCR产物酶切及电泳检测；4)对待测番茄样品中是否含有Mi‑1基因和ty‑5基因进行鉴定。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王银磊，赵统敏，余文贵，赵丽萍，杨玛丽，姜静，李亚茹，
申请(专利权)人：江苏省农业科学院，
类型：发明
国别省市：江苏;32