尼罗罗非鱼Ly75基因克隆、原核表达与抗罗非鱼OnLy75多克隆抗体的制备方法技术

本发明专利技术涉及尼罗罗非鱼淋巴细胞抗原75(OnLy75)的克隆、原核表达和抗罗非鱼OnLy75多克隆抗体制备的方法。公开了OnLy75基因全长序列，该序列如序列表中SEQ ID NO.1所示。所述OnLy75的编码序列位于SEQ ID NO.1的5’端第88～5286位脱氧核苷酸，编码1732个氨基酸，氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示。公开了用于制备OnLy75多克隆抗体的多肽序列，具体为序列表SEQ ID NO.4所示的序列，以及用于制备所述多克隆抗体的组合物。公开了制备抗罗非鱼OnLy75多克隆抗体的方法、由该方法获得的兔多克隆抗体及其在Western Blot检测中的应用。

【技术实现步骤摘要】
尼罗罗非鱼Ly75基因克隆、原核表达与抗罗非鱼OnLy75多克隆抗体的制备方法
：本专利技术涉及基因工程
，具体为尼罗罗非鱼(Oreochromisniloticus)生殖细胞表面标记基因淋巴细胞抗原75(OnLy75)的克隆、原核表达和抗罗非鱼OnLy75多克隆抗体制备的方法。
技术介绍
：淋巴细胞抗原75基因(LymphocyteAntigen75，Ly75)也称为DEC205/CD205基因或gp200-MR6基因。该基因编码的I型跨膜表面蛋白属于C型凝集素超家族成员之一，该蛋白超家族还包括甘露糖受体(Mannosereceptor,MR)，M型磷脂酶A2受体(M-typephospholipaseA2receptor,PLA2R)和尿激酶型纤维蛋白溶酶原激活剂相关蛋白(uPAR-associatedprotein,uPARAP/Endo180)。Ly75最先发现于鼠树突状细胞和胸腺上皮细胞表面，随后人的Ly75基因得到克隆，序列分析表明这种蛋白与MR、PLA2R在整体结构上相似，差别仅在于该蛋白包含10个CTLDs结构域。之后的研究发现Ly75分布广泛，不仅在树突状细胞中表达，还在胸腺上皮细胞、肺泡上皮细胞、肠上皮细胞等上皮细胞中，B淋巴细胞、T淋巴细胞等免疫细胞以及生殖细胞中表达。哺乳动物Ly75的研究主要集中于该基因在免疫系统中发挥的作用；鱼类Ly75的研究虽然起步较晚，但已在虹鳟(Rainbowtrout)、太平洋蓝鳍金枪鱼(Thunnusorientalis)、大西洋鲑(Atlanticsalmon)和斑马鱼(Daniorerio)等鱼类中有相关研究报道，而罗非鱼中尚未见相关研究报道。虹鳟中的研究结果表明Ly75主要在精巢和鳃中表达，在头肾和脑表达较弱；在精巢中的原位杂交和免疫组化结果显示Ly75mRNA和蛋白质主要在A型精原细胞中特异表达。在太平洋蓝鳍金枪鱼、大西洋鲑和斑马鱼的研究中，原位杂交和免疫组化实验也得到了类似的结果，即Ly75的mRNA和蛋白质都在A型精原细胞中有特异表达。进一步的研究也证实了在硬骨鱼中Ly75的氨基酸序列具有高度的保守性。因此认为Ly75可作为某些鱼类原始生殖细胞A型精原细胞的标记基因来研究。罗非鱼原产于非洲，1956年首次被引入我国，由于其生长快、食性杂、抗病力强，对水质要求较低，适合于各种养殖模式，因而规模化养殖发展极为迅猛，目前已成为世界性的主要养殖鱼类，也是我国最大宗的出口淡水养殖品种，产量和出口量分别占全球总量的40％和70％左右。在生产养殖中，罗非鱼性成熟早、繁殖周期短、繁殖力强，雌、雄鱼混养易使成鱼规格不整齐，进而影响经济效益。且罗非鱼的生长过程中，雄鱼比雌鱼生长快40％～50％，在相同条件下，若能进行全雄养殖，则可极大地提高罗非鱼单位面积产量和商品鱼的规格。因而对于罗非鱼而言，研究其精原细胞标记基因，对于鱼类性别控制的研究具有重要作用。
技术实现思路
：本专利技术目的是提供一种尼罗罗非鱼淋巴细胞抗原75基因(OnLy75)克隆、原核表达和抗罗非鱼OnLy75多克隆抗体的制备方法。在本专利技术中，申请人从尼罗罗非鱼在受精后8.5天的整个胚胎的cDNA中分离出一个尼罗罗非鱼淋巴细胞抗原75基因。本专利技术提供的淋巴细胞抗原75基因，名称为OnLy75，尼罗罗非鱼淋巴细胞抗原75基因。OnLy75的cDNA序列为序列表中SEQIDNO.1所示的核苷酸序列。共有6632个碱基组成，包含5199bp的开放阅读框，87bp的5’非翻译区和1346bp的3’非翻译区。开放阅读框起始于起始密码子ATG，终止于终止密码子TAA。所述尼罗罗非鱼OnLy75基因的编码序列位于序列表SEQIDNO.1的5’端第88～5286位脱氧核苷酸，编码1732个氨基酸。5’非翻译区位于序列表SEQIDNO.1的5’端第1～87位脱氧核苷酸，3’非翻译区位于序列表SEQIDNO.1的5’端第5287～6632位脱氧核苷酸。本专利技术提供的淋巴细胞抗原75蛋白名称为OnLy75，尼罗罗非鱼淋巴细胞抗原75蛋白，其氨基酸序列为序列表中SEQIDNO.2所示的氨基酸序列。序列表中的SEQIDNO.2所示的OnLy75蛋白共由1732个氨基酸残基所组成，使用ExPASy服务器上的工具ProtParam分析其的理化性质，结果显示OnLy75的分子量为196.5千道尔顿，理论等电点为6.41，总共包括27060个原子，推测其分子式为C8714H13253N2379O2606S108；在组成OnLy75蛋白的20种氨基酸中，丝氨酸所占的比例最高，达到8.3％，而蛋氨酸所占的比例最低，为2.5％；脂肪指数为67.22，半衰期是30h，不稳定指数是38.17，属于稳定蛋白；亲水性平均指数是-0.476，属于亲水性蛋白。用SignalP4.1Server在线分析，结果表明OnLy75蛋白为分泌蛋白，存在信号肽序列，具体序列为MLSLSRAPLCLCLLILLEAAVHWGTG，说明OnLy75蛋白可能在跨膜运输中起信号识别作用；剪切位点位于SEQIDNO.2所示的氨基酸序列的第26和27位氨基酸之间，成熟肽始于第26位氨基酸之后。使用TMHMM2.0对OnLy75蛋白成熟肽链进行跨膜区分析，预测结果显示SEQIDNO.2所示的氨基酸序列的第27～1630位氨基酸位于细胞膜表面，1631～1653位氨基酸之间形成一个典型的跨膜螺旋区，与该蛋白质的疏水性区域分析结果基本一致，表明OnLy75蛋白可能是一个与细胞信号传导有关的膜受体蛋白。使用SMART软件在线搜索OnLy75氨基酸的保守结构域，结果显示：OnLy75存在1个SP(Thesignalpeptide)，1个CysR(cysteine-rich)，1个FNII(fibronectinII)，10个CTLDs(C-typelectin-like)和1个TM(transmembrane)结构域。本专利技术的第二目的是提供一种罗非鱼OnLy75蛋白原核表达的方法，包括下列步骤：(1)提取尼罗罗非鱼受精后8.5天胚胎的总RNA；(2)构建用于表达罗非鱼OnLy75蛋白的大肠杆菌重组表达载体；(3)将重组表达载体导入大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)中，构建携带重组表达载体的工程菌；(4)工程菌扩大培养至OD600达到0.4～0.6时，通过IPTG诱导OnLy75重组蛋白表达；(5)抽提诱导表达后的工程菌总蛋白，通过SDS-PAGE电泳鉴定OnLy75重组蛋白的表达；(6)过柱纯化OnLy75重组蛋白。进一步的，步骤(2)中，构建重组表达载体时，克隆尼罗罗非鱼OnLy75基因所用的引物见表1。进一步的，步骤(2)中，构建重组表达载体所涉及的核苷酸序列为序列表中SEQIDNO.3所示的核苷酸序列。该序列位于序列表SEQIDNO.1的5’端第3928～5120位。PCR扩增条件为：95℃预变性5min，95℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸1min，进行35个循环，最后72℃延伸10min。进一步的，步骤(4)所用IPTG的浓度为0.5mmol/L，诱导时间为4小时。进一步的，步骤(5)中抽提诱导表达后的工程菌总蛋白所用方法为超声破碎法，其中超声破碎仪设本文档来自技高网...

【技术保护点】
尼罗罗非鱼Ly75基因克隆，其特征在于尼罗罗非鱼OnLy75基因全长序列，该序列为序列表中SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

【技术特征摘要】
1.尼罗罗非鱼Ly75基因克隆，其特征在于尼罗罗非鱼OnLy75基因全长序列，该序列为序列表中SEQIDNO.1所示的核苷酸序列。2.根据权利要求1所述尼罗罗非鱼Ly75基因克隆，其特征在于OnLy75的编码序列位于序列表SEQIDNO.1的5’端第88～5286位脱氧核苷酸，编码1732个氨基酸，氨基酸序列的序列表SEQIDNO.2所示氨基酸序列构成的蛋白质。3.根据权利要求2所述尼罗罗非鱼Ly75基因克隆，其特征在编码基因重组蛋白的多肽的氨基酸序列由SEQIDNO.4所示的氨基酸序列，该序列处于SEQIDNO.2所示的氨基酸序列的第1281—1677位。4.根据权利要求1所述尼罗罗非鱼Ly75基因克隆，其特征在于构建用于表达罗非鱼OnLy75蛋白的大肠杆菌重组表达载体所涉及核苷酸序列为序列表中SEQIDNO.3所示的核苷酸序列。5.根据权利要求2所述尼罗罗非鱼Ly75基因克隆，其特征在于罗非鱼OnLy75重组蛋白的氨基酸序列为序列表中SEQIDNO.4所示的氨基酸序列，该多肽的氨基酸序列处于SEQIDNO.2所示的氨基酸序列的第1281—1677位。6.根据权利要求3所述尼罗罗非鱼Ly75基因克隆...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹建萌，卢迈新，陈琼，高风英，刘志刚，陈昆平，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院珠江水产研究所，
类型：发明
国别省市：广东,44