一种新的植酸酶的克隆和表达制造技术

本发明专利技术涉及一种新的植酸酶、编码这个酶的基因及其生产菌株无丙二酸柠檬酸杆菌（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ　　ａｍａｌｏｎａｔｉｃｕｓ　　Ｂ－５２）。该植酸酶具有如下性质：比活高达３５４８±３４Ｕ／ｍｇ，良好的ｐＨ稳定性和热稳定性，最适ｐＨ４．５，最适温度５５℃，强的蛋白酶抗性，且易于工业化发酵生产。本发明专利技术也涉及含有所述基因的重组载体，含有所述载体的宿主细胞，利用基因工程方法产生植酸酶的方法。而且，本发明专利技术还涉及植酸酶在制备饲料添加剂中的用途以及相应的饲料添加剂。此外，本发明专利技术还提供了一种全新的分离植酸酶基因的方法。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于微生物工程领域，具体涉及一种具有高稳定性和高活性的植酸酶、其生产菌株的筛选、植酸酶基因的克隆分离、植酸酶基因在宿主细胞(如毕赤酵母)中的表达纯化及其酶学性质的研究。
技术介绍
在动物日粮中，植酸磷占总磷量的50-70％，甚至更高。但是，单胃动物缺乏分解植酸的酶，因此磷的利用率非常低。在通过消化道时植酸磷不能被动物吸收。大量的植酸排泄到环境中，导致土壤和水中磷的富积，造成环境污染。另外，植酸还可以与大量必要离子结合，抑制了这些元素的吸收。同时植酸还可以与其他营养物质结合，降低了饲料的利用率。显然磷是生长所必需的，因此为了动物的正常生长添加无机磷(磷酸二氢钙、去氟磷酸盐)或动物性产品(肉骨粉、鱼粉)是非常必要的，但是价格比较昂贵。植酸酶是能够将谷物中磷的储存形式的植酸(肌醇六磷酸)(E Graf，KL Empson and JW Eaton.Phytic acid.A natural antioxidant.J.Biol.Chem.，Vol.262，Issue 24，11647-11650，Aug，1987)水解为无机磷和肌醇的一类酶的总称。植酸酶广泛地存在于动物、植物和微生物之中。根据不同来源植酸酶的性质特征的差异，微生物来源的植酸酶倍受关注。作为饲料添加剂，微生物植酸酶大量提高了单胃动物日粮中植酸磷的生物学活性(Cromwell，et al.Efficacy of phytase in improving the bioavailability ofphosphorus in soybean meal and corn-soybean meal diets for pigs.J AnimSci.1993 Jul；71(7)1831-40)。结果降低了动物饲料中无机磷的添加量，同时减少了环境中磷的排放(Kornegay，et al.Replacement of inorganicphosphorus by microbial phytase for young pigs fed on amaize-soyabean-meal diet.Br J Nutr.1996 Oct；76(4)563-78)。一方面，随着基因工程技术的发展，越来越多的微生物植酸酶被分离纯化。例如，“来源于Klebsiella terrigena的植酸酶纯化与性质测定”(Greiner et al.Purification and characterization of a phytase from Klebsiella terrigena.Arch Biochem Biophys.1997 May 15；341(2)201-6)，“来源于芽孢杆菌种DS11的热稳定性植酸酶的纯化与性质测定”(Kim et al.Purification andproperties of a thermostable phytase from Bacillus sp.DS11.EnzymeMicrob Technol，1998 Jan，22(1)，2-7)，“Citrobacter braakii来源的植酸酶分离及性质测定”(Kim et al.Isolation and characterization of a phytasewith improved properties from Citrobacter braakii.Biotechnol Lett.2003Aug；25(15)1231-4)，“来源于Obesumbacterium proteus的新型植酸酶的基因克隆表达及性质测定”(Zinin et al.Gene cloning，expression andcharacterization of novel phytase from Obesumbacterium proteus.FEMSMicrobiol Lett.2004 Jul 15；236(2)283-90)；另一方面，还通过直接定点突变或基因改组，对已有的植酸酶进行性质改良。例如，“植酸酶phyAm基因结构延伸突变改善酶的热稳定性”(陈惠等，生物工程学报，2005年11月，21卷6期，983-987)，“大肠杆菌植酸酶的定点突变”(US patent6,841,370，Lei XG，Site-directed mutagenesis of Escherichia coli phytase.2005)。所以微生物来源的植酸酶的价格大幅度的降低。由于这些优点，部分植酸酶在饲料行业被广泛的接受应用。但是，在这些已广泛使用的植酸酶中，仍然存在着一些缺陷。因为这些植酸酶作为饲添加剂，并不能发挥它的理想作用。例如，大部分植酸酶在饲料制粒加工的过程中就已经高温变性失活了，所以在肠道中不能发挥降解植酸的作用。不同的植酸酶在饲料中不能真正发挥作用的原因，主要是由于，这些酶的稳定性比较差(pH稳定性、热稳定性、抗蛋白酶降解的稳定性以及在储存运输过程中的稳定性)和在胃肠道环境中活性比较低的缘故。由于目前使用的植酸酶存在的这些缺陷，因此，人们希望能够找到这样一种新的植酸酶其具有非常好的稳定性，在动物胃肠道中有非常高的活性，并且该植酸酶还能够通过发酵技术大量生产，这样可以使其成本大幅度的降低，从而能够进一步推广该植酸酶的使用。另外，现有技术中分离植酸酶的手段有限，主要是通过构建基因组文库，或直接从纯化蛋白入手。但是，这两种方式都比较耗费时间和劳力，效率非常的低，并且也非常昂贵。而且，鉴于不同物种中植酸酶基因的同源性很低，难以通过简单的PCR直接筛选到新的植酸酶基因。因此，本领域也急需发展新的简便有效的植酸酶分离方法专利技术概述首先，本专利技术提供了一株产高活性高稳定性植酸酶的菌株无丙二酸柠檬酸杆菌(Citrobacter amalonaticus)B-52，其保藏号为CGMCC 1696。本专利技术也提供了一种新的植酸酶基因，其包含SEQ ID NO1所示的核苷酸序列或其衍生序列。本专利技术还提供了具有如下性质的植酸酶，其理论分子量46.5kDa，最适pH在4-5之间，最适温度在50-60℃之间，理论pI值为6.2，比活在3000U/mg以上，且在pH 1-10之间都具有良好的pH稳定性。所述植酸酶可分离自柠檬酸杆菌属微生物，优选为无丙二酸柠檬酸杆菌。本专利技术也涉及一种分离的多肽，其选自a)包含SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽；b)由SEQ ID NO2所示的多肽序列经过1-10氨基酸的取代、缺失和/或插入衍生且具有植酸酶活性的多肽；c)由SEQ ID NO1所示的核酸分子或其简并序列所编码的多肽；d)由在严谨条件下与SEQ ID NO1所示核酸分子的互补链杂交的核酸编码且具有植酸酶活性的多肽；e)由SEQ ID NO1所示核酸分子的等位基因或天然变体所编码且具有植酸酶活性的多肽；或 f)与SEQ ID NO2所示的多肽序列具有至少70％同源性且具有植酸酶活性的多肽。特别地，本专利技术还提供了一种简单有效的从基因组DNA中克隆分离植酸酶的基因的方法。所述方法包括a)基于植酸酶保守序列RHGXRXP和HD设计一对简并引物；b)利用所述引物通过PCR扩增部分植酸酶序列；和c)进一步通过T本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分离的具有如下性质的植酸酶蛋白：ａ）理论分子量４６．５ｋＤａ；ｂ）最适ｐＨ在４－５之间；ｃ）最适温度在５０－６０℃之间；ｄ）理论ｐＩ值为６．２；ｅ）比活在３０００Ｕ／ｍｇ以上；且ｆ）对胃蛋白酶、胰蛋白酶具有高抗性。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：姚斌，罗会颖，黄火清，王亚茹，袁铁铮，史秀云，柏映国，孟昆，杨培龙，
申请(专利权)人：中国农业科学院饲料研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]