乳酸菌谷氨酸脱羧酶基因的克隆、表达及应用制造技术

本发明专利技术涉及一种乳酸菌谷氨酸脱羧酶基因的克隆、表达及应用，属于食品工业生物技术领域。该基因来自唾液链球菌嗜热亚种（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ），长１３８０ｂｐ。通过ＰＣＲ从基因组ＤＮＡ中扩增获得，在该基因两端分别加上ＮｃｏⅠ和ＥｃｏＲⅠ限制酶识别序列，与经相同限制酶消化的ｐＥＴ－ＤｓｂＡ连接并转化大肠杆菌表达宿主菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ，实现了在大肠杆菌中的重组表达，表达产物谷氨酸脱羧酶分子量为５２．４ｋＤａ。重组酶可将Ｌ－谷氨酸脱羧转化为γ－氨基丁酸。该基因的表达为γ－氨基丁酸的酶法合成提供大量的、高活力的粗酶，降低酶法合成γ－氨基丁酸的成本。这种γ－氨基丁酸的合成方法属于生物合成法，反应条件温和，作用专一，无副产物，在食品、医药、饲料等行业中均有应用价值。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种乳酸菌谷氨酸脱羧酶基因的克隆、表达及应用，属于食品工业生 物

技术介绍
Y-氨基丁酸(γ-Aminobutyric acid, GABA)，又叫氨酪酸，是一种非蛋白质组成 的天然氨基酸，为哺乳动物中枢神经系统一种主要的抑制性神经递质，具有重要的生理功 能，如降低血压、利尿、镇痛安神、改善脑机能、增进脑活力、促进长期记忆、营养神经细胞、 改善更年期综合症等。当大脑长期缺乏GABA将会导致癫痫、帕金森等疾病。同时GABA还与 脑衰老有关，其缺乏将导致老年人“耳不聪、目不明”。另外，GABA能促进精子的穿卵能力，提 高受精率，以及可以提高饲料利用率和日增重。Y-氨基丁酸正被广泛应用于医药、食品保 健、化工及农业等行业。GABA的生产可以通过化学合成和生物合成。由于化学合成反应条 件剧烈，化学原料和溶剂具有毒性或腐蚀性，副产物多，缺乏安全性，主要应用于化工行业， 不适宜作为食品添加剂和医药。生物合成条件温和、专一性强、副产物少、安全性高，因此以 生物合成法生产食品或医药级GABA是一条较理想的途径。谷氨酸脱羧酶(Glutamate decarboxylase, GAD)是生物体内催化谷氨酸发生 α -脱羧生成GABA的唯一的酶。谷氨酸脱羧酶是一种依赖于5’-磷酸吡哆醛的脱羧酶，将 L-谷氨酸的α-羧基脱去，反应产物为CO2和Y-氨基丁酸，其催化反应如下图。HOOC-CH2-CH2-CH (NH2) -COOH — CO2+HOOC-CH2-CH2-CH2-NH2目前已在多种微生物中发现了 GAD的存在，利用微生物中的GAD催化谷氨酸生产GABA，不受资源、环境和空间的限制，具有显著的优点。通过检索，查到下列利用不同微 生物生产Y-氨基丁酸的文献文摘用海藻酸钙包埋法将大肠杆菌细胞制成固定化细 胞，与1 %谷氨酸溶液进行间歇反应、连续搅拌式反应及连续柱式反应生产GABA，间歇反 应5小时转化率达到了 100% ；连续搅拌式反应在三角瓶反应器中进行，以6ml/h的流速 输入底物溶液和输出反应液，转化率达85% ；在连续柱式反应器中反应，控制流速12ml/ h，转化率达95%。赵景联等，生物工程学报，1989，5 (2) :124_128。文摘用海藻酸钙包 埋法将大肠杆菌细胞制成固定化细胞，对后道味精母液提取谷氨酸后的废液进行转化生 产GABA，GABA含量达到了 98. 94%，收率为49. 65%。章汝平等，长沙电力学院学报(自然 科学版)，1998，13 (4) :433-435。文摘介绍了对Koji制作中GABA的变化，GABA含量达 至 Ij 了 120yg/g。Kono I 等，Biosci. Biotechnol. Bioenchem.，2000，64 (3) :617_619。文 摘利用 Monascus purpuresuNTU601 进行固体发酵，GABA 含量达到了 5004mg/kg。Wang JJ 等，J. Ind. Microbiol. Biotechnol.，2003，30 :669_676。文摘报道 了采用 Monascus purpureus CCRC31615 进行固体发酵，GABA 含量达到 了 1200mg/kg。Su YC 等，J. Ind. Microbiol. Biotechnol.，2003，30(1) :41_46。文摘介绍了从生产奶酪的菌株中分离到 一株Lactococcus Iactis 01-7，用于奶酪生产，奶酪的GABA含量达到了 250mg/100ml。许 建军，博士学位论文，江南大学，2004年2月。文摘也对高产GABA乳酸菌筛选和发酵条件进行了报道，发酵液中的GABA达到3. lg/1。刘清等，氨基酸和生物资源，2004，26(1) 40-43。文摘报道了利用Lactobacillus brevisIF012005对酒糟进行发酵，GABA含量达 到了 10. 18mM，通过离心、絮凝、脱色和脱臭处理获得了较好的GABA溶液，可用于食品强化 GABA。 Yokoyama S J. Biosci. Bioeng. , 2002,93 (1) :95_97。^；才||$_ Lactobacillus plantarum利用含有米糠抽提液的培养基发酵生产GABA，在干粉中含量达到了 5%。爱宕世 高等，食品科学，2001，No.8，81-85。文摘从韩国传统食品Kimchi中分离的Lactobacillus brevis 0PK-3合成GABA的能力为84. 292mg/L/h。将其谷氨酸脱羧酶基因克隆并在大肠杆 菌UT481中表达，表达产物分子量为53. 4kDa，GAD的活力显著提高。Park K. B.，Oh S. H.， Biores. Technol.，2007，98 :312_319。文摘将 Lactobacillus brevis 的谷氨酸脱羧羧酶 基因与大肠杆菌_芽孢杆菌穿梭载体PLip连接后转化枯草杆菌168，得到的重组芽孢杆菌 合成GABA的能力明显高于对照。将重组芽孢杆菌接入韩国传统食品Chungkukjang后，也 提高了食品中 GABA 的含量。Park K. B.，OhS. H.，Biotechnol. Lett.，2006，28 :1459_1463。本专利技术课题组专利“利用唾液链球菌嗜热亚种生产Y-氨基丁酸的方法”， 公开号CN1710088，公开日2005. 12. 21，该专利公开了以唾液链球菌嗜热亚种 (StreptococcusthermophiIus)为菌种，作用于谷氨酸、谷氨酸盐、含谷氨酸或谷氨酸盐的 物质，使谷氨酸的α-羧基发生脱羧作用，从而生成Y-氨基丁酸，该法属于生物合成法。本 专利技术涉及的谷氨酶脱羧酶基因即来自该菌株。
技术实现思路
技术问题本专利技术的目的是提供一种乳酸菌谷氨酸脱羧酶基因、表达产物及其用途。来自于 唾液链球菌嗜热亚种谷氨酸脱羧酶基因的表达产物重组谷氨酸脱羧酶，用于生产Y-氨基 丁酸。技术方案一种乳酸菌谷氨酸脱羧酶全长基因，其序列为SEQ ID Ν0. 1，来自唾液链球菌嗜热 亚种Str印tococcus thermophilus，长1380bp。该基因是一个以前没有人发现过的DNA序 列，其碱基组成为碱基数目百分比A 401 29. 06C 229 16.59G 350 25. 36T 400 28. 99G+C 579 41.96该基因编码的推导氨基酸序列为SEQ ID N0. 2。其表达产物重组谷氨酸脱羧酶，分 子量为52. 4kDa。重组谷氨酸脱羧酶在生产Y -氨基丁酸方面的应用，可高效地将谷氨酸转 变为Y "氨基丁酸，其最佳反应温度为55°C，最佳反应pH为5. O。有益效果目前谷氨酸脱羧酶基因已公布的乳酸菌有Lactobacillus brevis, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus plantarum 禾口 Lactococcus lactis，H明入胃隆的唾液链球菌嗜热亚种谷氨酸脱羧酶基因为国际上首次报道。本专利技术人在前期工作中分离到一株具有高活力谷氨酸脱羧酶的唾液链球菌嗜热亚种，在分析数种细菌谷氨酸脱羧酶蛋白本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种乳酸菌谷氨酸脱羧酶基因，其序列为ＳＥＱＩＤＮＯ．１，来自唾液链球菌嗜热亚种（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ），长１３８０ｂｐ。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：陆兆新，林谦，吕凤霞，别小妹，焦阳，王煜，邹晓葵，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：84[中国|南京]