一种改造已知载体多克隆位点的方法技术

本发明专利技术公开了一种改造已知载体多克隆位点的方法，即衔接子引物-PCR法，包括以下步骤：应用一对5’末端分别添加了多个限制性酶切位点的衔接子引物扩增任一物种中的已知DNA片段；用扩增片段两端的限制性内切酶双酶切，再用T4DNA连接酶将其连接至待改造载体的多克隆位点中；将连接产物转化感受态大肠杆菌，挑取阳性克隆，提取质粒，酶切验证改造的载体是否带有新的酶切位点，保留正确的质粒载体。本发明专利技术能在已知载体多克隆位点中快速、便捷的添加新的酶切位点，以满足具体实验的需要，成本低廉，灵活性高，可应用于改造已知载体多克隆位点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于克隆
，具体涉及。
技术介绍
应用双酶切对目标序列进行定向克隆是载体构建过程中最常用的方法。这一方法能极大地减少重组过程中的载体本身自连现象，提高构建效率。然而，在很多情况下，尤其是待克隆的目标DNA片段较长时,很难在已知载体的多克隆位点multiple cloning sites(简称MCS)中找到2个合适 的限制性内切酶酶切位点。另外，在双酶切过程中，有些限制性内切酶之间的组合会严重降低彼此或其中之一的酶切效率，最终影响构建效率。因此，对载体的多克隆位点进行改造是分子生物学实验中的常见情况，而这时便需要一种简便、高效的多克隆位点改造方法。目前，对载体的多克隆位点进行改造的方法主要有3种:I)直接合成一段双链DNA片段，双酶切消化、回收后连接至原载体。由于合成的片段较短，该方法在胶回收过程中的得率通常较低。2)基于连接子linker技术的方法，合成两个含所需酶切位点的互补的寡核苷酸序列，常规引物5’末端为羟基，用于连接子的引物5’末端需磷酸化，在PCR反应中通过退火获得具有粘性末端的双链的DNA片段，尔后不经过胶回收，直接与待改造的载体进行常规的酶切连接反应，完成原载体多克隆位点的改造。然而，由于不经过胶回收，导致原退火反应中的缓冲液残留会影响下一步连接酶的连接效率。3)以另一载体的多克隆位点为来源，通过酶切、回收、再连接至待改造载体的多克隆位点中。然而，由于载体中的多克隆位点序列通常较短，为IOObp左右，使得酶切后的片段在胶回收中的得率通常不高，导致构建效率低。牛麟等提出在载体的MCS中插入一段238bp的辅助片段，尔后再用此MCS取代待被改造载体的MCS，最后再切除插入的辅助片段，完成载体的改造，但是该方法需要有原始的MCS模板序列，导致操作灵活性较低。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供，以实现简便快捷、可操作性强、效率高地改造已知载体多克隆位点。为了解决以上技术问题，本专利技术采用的技术方案如下: ，即衔接子引物-PCR法，其特征在于包括以下步骤:步骤一，设计衔接子引物，用衔接子引物对目标片段进行扩增；步骤二，利用原载体已知酶切位点分别对扩增片段与原载体进行双酶切，酶切后进行凝胶电泳，切胶后采用凝胶回收试剂盒回收目标片段，片段回收后通过T4 DNA连接酶进行连接反应；步骤三，连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，挑取阳性克隆，提取质粒，验证新引入的酶切位点的正确性。所述步骤一中设计衔接子引物的方法为:以实验中现有的在动植物或昆虫等物种基因组中扩增效率较好的引物对为基础引物，避免基础引物及其扩增序列中包含所要添加的酶切位点，扩增序列长度在IKb以内；在基础引物对的前引物5’端依次添加酶切保护碱基、待改造载体多克隆位点中的某一酶切位点序列以及需添加的酶切位点序列，获得衔接子iu引物序列；在基础引物对的后引物5’端依次添加保护喊基、待改造载体多克隆位点中另一酶切位点序列以及需添加的酶切位点序列，获得衔接子后引物序列；以衔接子前后引物对，扩增原基础引物扩增的基因组DNA即模板DNA，获得目标片段。所述衔接子引物-PCR法的反应体系为20 μ 1，包含2 μ I即IOOng模板DNA、2 μ I的IOX聚合酶缓冲液、0.4μ I的IOmM dNTP ；0.4μ I的10 μ M衔接子前后引物各，I μ I的高保真聚合酶、13.8 μ I的超纯水；PCR方法的过程为:在94°C下预变性5分种；在94°C下变性30秒，在55°C下退火30秒，在72°C延伸I分种，循环35次；在72°C下延伸5分钟；12°C保温2小时；退火温度根据所设计引物的基础引物退火温度作相应调整。所述步骤二中双酶切体系中各试剂及用量分别为:扩增片段酶切体系为60ul，试剂包括20 μ I的衔接子引物扩增片段、6.0 μ I的IOX内切酶缓冲液、1.0 μ I的内切酶1、Ι.Ομ I的内切酶II和32 μ I的超纯水；载体酶切体系为60ul，试剂包括15 μ I即600ng的载体、6.0μ I的IOX内切酶缓冲液、Ι.Ομ I的内切酶Ι、1.0μ I的内切酶II和37 μ I的超纯水。采用1%琼脂糖凝胶对所述酶切产物进行电泳检测。对符合预期大小的原载体酶切片段、衔接子引物扩增产物的酶切片段，采用Promga公司的凝胶回收试剂盒进行回收。将各片段的回收产物采用Τ4 连接酶进行连接反应。所述步骤二中连接反应体系中各试剂及用量分别为:衔接子引物扩增片段酶切回收产物4.0 μ 1，原载体酶切回收产物2.0 μ 1，10ΧΤ4连接缓冲液1.0 μ 1，Τ4连接酶1.0 μ I和超纯水2.0 μ I;连接条件为在温度16°C下，连接8小时。所述步骤三中感受态细胞为:大肠杆菌菌株DH5 α或ToplO ;正确的重组质粒为在使用新的限制性内切酶双酶切后，在凝胶电泳中出现2条电泳条带，其中一条与原载体片段大小接近，另一条带与原基础引物扩增片段大小接近。连接产物大肠杆菌转化与PCR阳性检测。采用化学转化法，将上述连接产物转化至大肠杆菌菌株DH5 α或Τ0Ρ10感受态细胞中。转化产物涂布于含有相应抗生素(与原载体中在细菌中筛选的抗生素相同)的LB平板上，37°C过夜培养。挑取平板中长出的单克隆菌落，进行单克隆PCR检测，检测用引物为原基础引物。PCR扩增产物采用1%琼脂糖凝胶进行电泳检测，电泳结果中出现与原基础引物扩增片段大小相同的电泳条带的单克隆为阳性克隆。对阳性克隆在含有相应抗生素的LB液体中进行扩繁培养，培养温度37°C，时间12小时，采用Promga公司的质粒提取试剂盒提取培养产物中的质粒DNA (或载体DNA)。采用与单克隆PCR阳性检测的相同方法对质粒DNA进行PCR检测，保存正确的重组质粒DNA或改造后的载体DNA。对改造后的载体进行酶切验证，确定新添加的酶切点有效。具体为:采用新添加的两个限制性内切酶对改造后的载体进行双酶切，酶切结果采用1%琼脂糖凝胶进行电泳检测；正确的改造载体的酶切产物在凝胶电泳中应该出现2条电泳条带，其中一条与原载体片段大小接近，另一条带与原基础引物扩增片段大小接近。本步骤中的双酶切体系为20ul，包括如下组分:试剂I用量(μ I)—权利要求1.，即衔接子引物-PCR法，其特征在于包括以下步骤: 步骤一，设计衔接子弓I物，用衔接子引物对目标片段进行扩增； 步骤二，利用原载体已知酶切位点分别对扩增片段与原载体进行双酶切，酶切后进行凝胶电泳，切胶后采用凝胶回收试剂盒回收目标片段，片段回收后通过T4 DNA连接酶进行连接反应； 步骤三，连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，挑取阳性克隆，提取质粒，验证新引入的酶切位点的正确性。2.一种如权利要求1所述的改造已知载体多克隆位点的方法，其特征在于所述步骤一中设计衔接子引物的方法为:以实验中现有的在动植物或昆虫等物种基因组中扩增效率较好的引物对为基础引物，避免基础引物及其扩增序列中包含所要添加的酶切位点，扩增序列长度在IKb以内；在基础引物对的前引物5’端依次添加酶切保护碱基、待改造载体多克隆位点中的某一酶切位点序列以及需添加的酶切位点序列，获得衔接子前引物序列；在基础引物对的后引物5’端依次添加保护碱基、待改造载体多克隆位点中另一酶切位点序列以及需添加的酶切本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种改造已知载体多克隆位点的方法，即衔接子引物?PCR法，其特征在于包括以下步骤：步骤一，设计衔接子引物，用衔接子引物对目标片段进行扩增；步骤二，利用原载体已知酶切位点分别对扩增片段与原载体进行双酶切，酶切后进行凝胶电泳，切胶后采用凝胶回收试剂盒回收目标片段，片段回收后通过T4?DNA连接酶进行连接反应；步骤三，连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，挑取阳性克隆，提取质粒，验证新引入的酶切位点的正确性。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：左示敏，薛芗，李磊，张亚芳，潘学彪，陈宗祥，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：