一种双精氨酸途径蛋白质分泌载体的构建方法及其应用技术

一种双精氨酸途径蛋白质分泌载体的构建方法，其特征在于构建过程为：　１）Ｔａｔ分泌途径信号肽编码基因的克隆：首先以枯草芽孢杆菌１６８株染色体为模板，采用引物Ｐ１和Ｐ２进行ＰＣＲ扩增基因ｐｈｏＤ的启动子Ｐ↓［ＰｈｏＤ］以及紧接该启动子下游 的信号肽编码序列ＳＰＣ↓［ＰｈｏＤ］部分，并克隆到亚克隆载体ｐＵＣ１８上得到重组载体ｐＵＣ１８－ｐｈｏＤｓｉｇ；　２）分泌载体ｐＭＡＳｉｇ的构建：以ｐＵＣ１８－ｐｈｏＤｓｉｇ载体ＤＮＡ作为模板，采用引物Ｐ４和Ｐ５进行ＰＣＲ反应扩增ＳＰ Ｃ↓［ＰｈｏＤ］单元片段，并将该片段克隆入大肠杆菌－枯草芽孢杆菌穿梭载体ｐＭＡ５中，得到重组载体ｐＭＡ５－Ｓｉｇ；再以枯草芽孢杆菌１６８株的染色体ＤＮＡ为模板，采用引物Ｐ６和Ｐ７扩增出ｔａｔＡｄ／Ｃｄ基因单元，并克隆入新构建的重组载体ｐＭＡ５－Ｓｉｇ中，得到重组载体ｐＭＡＳｉｇ；　３）用于分泌耐热－半乳糖苷酶的重组载体ｐＭＡＳｉｇｂｇａＢ０５的构建：以嗜热脂肪芽孢杆菌ＩＡＭ１１００１的染色体ＤＮＡ为模板，采用引物Ｐ１１和Ｐ１２进行ＰＣＲ反应扩增耐热－半乳糖苷酶的编码基因 ｂｇａＢ，并将该基因克隆到载体ｐＭＡＳｉｇ中，得到重组载体ｐＭＡＳｉｇｂｇａＢ０５；　４）将载体ｐＭＡＳｉｇｂｇａＢ０５转化到枯草芽孢杆菌１６８株中，在含５０ｇ／ｍｌ卡那霉素的ＬＢ平板上筛选含ｐＭＡＳｉｇｂｇａＢ０５的重组菌，并将该菌 株命名为枯草芽孢杆菌株１６８（ｐＭＡＳｉｇｂｇａＢ０５），保藏号为ＣＧＭＣＣ　Ｎｏ．２７２０。

【技术实现步骤摘要】

【技术保护点】
一种双精氨酸途径蛋白质分泌载体的构建方法，其特征在于构建过程为：　１）Ｔａｔ分泌途径信号肽编码基因的克隆：首先以枯草芽孢杆菌１６８株染色体为模板，采用引物Ｐ１和Ｐ２进行ＰＣＲ扩增基因ｐｈｏＤ的启动子Ｐ↓［ＰｈｏＤ］以及紧接该启动子下游的信号肽编码序列ＳＰＣ↓［ＰｈｏＤ］部分，并克隆到亚克隆载体ｐＵＣ１８上得到重组载体ｐＵＣ１８－ｐｈｏＤｓｉｇ；　２）分泌载体ｐＭＡＳｉｇ的构建：以ｐＵＣ１８－ｐｈｏＤｓｉｇ载体ＤＮＡ作为模板，采用引物Ｐ４和Ｐ５进行ＰＣＲ反应扩增ＳＰＣ↓［ＰｈｏＤ］单元片段，并将该片段克隆入大肠杆菌－枯草芽孢杆菌穿梭载体ｐＭＡ５中，得到重组载体ｐＭＡ５－Ｓｉｇ；再以枯草芽孢杆菌１６８株的染色体ＤＮＡ为模板，采用引物Ｐ６和Ｐ７扩增出ｔａｔＡｄ／Ｃｄ基因单元，并克隆入新构建的重组载体ｐＭＡ５－Ｓｉｇ中，得到重组载体ｐＭＡＳｉｇ；　３）用于分泌耐热－半乳糖苷酶的重组载体ｐＭＡＳｉｇｂｇａＢ０５的构建：以嗜热脂肪芽孢杆菌ＩＡＭ１１００１的染色体ＤＮＡ为模板，采用引物Ｐ１１和Ｐ１２进行ＰＣＲ反应扩增耐热－半乳糖苷酶的编码基因ｂｇａＢ，并将该基因克隆到载体ｐＭＡＳｉｇ中，得到重组载体ｐＭＡＳｉｇｂｇａＢ０５；　４）将载体ｐＭＡＳｉｇｂｇａＢ０５转化到枯草芽孢杆菌１６８株中，在含５０ｇ／ｍｌ卡那霉素的ＬＢ平板上筛选含ｐＭＡＳｉｇｂｇａＢ０５的重组菌，并将该菌株命名为枯草芽孢杆菌株１６８（ｐＭＡＳｉｇｂｇａＢ０５），保藏号为ＣＧＭＣＣ　Ｎｏ．２７２０。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：陈卫，夏雨，张灏，陈海琴，赵建新，田丰伟，刘晓鸣，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：32