本发明专利技术涉及基因重组和蛋白表达领域，具体说是一种蛋白分泌型哺乳动物细胞表达载体克隆表达区基因的设计及其应用，设计并合成一种载体克隆表达区基因，其具有序列表SEQ ID NO：1中碱基序列；将该基因片段克隆连接至哺乳动物细胞表达载体pcDNA3.1的Nhe I和Hind III限制性内切酶识别位点区间，构建了一种新型表达载体pcDNA3.1-secreting，该载体可使编码基因连接于多克隆位点处的外源蛋白在哺乳动物宿主细胞中以胞外分泌的形式表达出来，分泌于细胞培养液中，便于收集和纯化。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因重组和蛋白表达领域，具体说是一种蛋白分泌型哺乳动物细胞表 达载体克隆表达区基因的设计及其应用，构建成一种新型的蛋白分泌型哺乳动物细胞表达 载体 pcDNA3. 1-secreting。
技术介绍
众所周知，大量哺乳动物来源的蛋白都是糖蛋白，这类蛋白在表达过程中需要翻 译后修饰。因此，如以基因工程技术来大量制备此类蛋白，原核宿主细胞如细菌细胞等是不 适合的。由于这个原因，研究者开发了利用高等真核细胞(如哺乳动物细胞）的蛋白表达系 统。然而，以哺乳动物细胞表达的蛋白，其生产和回收技术存在的主要问题是这些蛋白主要 被表达于细胞质内，而不能分泌到细胞外空间，因此后续对这些蛋白的纯化必须先裂解细 胞，然后经几步程序使所表达的目的蛋白与其它胞内蛋白分离。解决这个问题的方法之一 是使表达的重组蛋白能够分泌到细胞外的培养基中。这样可以较为容易而有效地进行纯 化。此外，分泌产生的重组蛋白的另一个优点是可避免被蛋白酶水解并且蛋白质正确折叠 的机会更大。蛋白质的成功分泌要求蛋白质能有效穿越内质网膜和细胞膜。这就需要在要 表达的目的蛋白氨基端连接一段附加的肽序列，此附加序列可使其后融合的目的蛋白分子 进入分泌通路。此附加肽序列被称为信号肽序列。 载体pcDNA3. 1载体是一种可在哺乳动物细胞中表达外源蛋白的表达载体，其高 效的CMV启动子，可在多种哺乳动物细胞中被高效激活，用于多种真核生物蛋白的表达。但 是pcDNA3. 1载体缺乏有效信号肽序列，不能将表达的蛋白质分子分泌到细胞外，这对于后 续对表达的蛋白的提取和分离造成严重不便。本专利技术在大量生物信息学模拟分析，多种序 列组合的设计和实际生物学活性筛选结果的基础上，对pcDNA3. 1载体进行改造，设计并合 成一种载体克隆表达区基因，构建了一种新型表达载体pcDNA3. Ι-secreting,该载体可使 编码基因连接于多克隆位点处的外源蛋白在哺乳动物宿主细胞中以胞外分泌的形式表达 出来，分泌于细胞培养液中，便于收集和纯化。
技术实现思路
本专利技术的目的是设计一种蛋白分泌型哺乳动物细胞表达载体克隆表达区基因及 其应用，获得一种能够有效的将外源蛋白分泌表达到细胞外培养基中的新型哺乳动物细胞 表达载体 pcDNA3. 1-secreting。 为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案为： 设计并合成载体克隆表达区基因，其具有序列表SEQ ID NO :1中碱基序列； SEQ ID NO ： 1 GGCTAGATGAGAGTTCCTCCTCAATTTCTGGGCTTGCTGC 40 TTTTGTGGCTTCCCGGGGTGAGGTGCAAGCTT 72 利用限制性核酸内切酶Nhe I和Hind III的酶切连接技术，将合成的载体克隆表 达区基因(序列表SEQ ID NO :1中碱基序列）整合入表达载体pcDNA3. 1克隆表达区，构建成 新型表达载体pcDNA3. Ι-secreting。该载体可使编码基因连接于多克隆位点处的外源蛋白 在哺乳动物宿主细胞中以胞外分泌的形式表达出来，分泌于细胞培养液中，便于收集和纯 化。 本专利技术具有如下优点： 1.本专利技术构建的新型表达载体pcDNA3. Ι-secreting,在紧邻启动子下游区添加 了高效的分泌信号肽序列，可使克隆于下游的外源编码基因表达的蛋白分子分泌到细胞外 培养基中，既方便了后续的纯化提取，省略了细胞破碎的过程；又避免表达的外源蛋白在细 胞内被胞内蛋白酶水解，因此可以显著提高蛋白表达效率。 2.本专利技术构建的新型表达载体pcDNA3. Ι-secreting,在启动子下游和多克隆位 点上游添加了 ATG起始密码子和Kozak序列，Kozak序列可以极大提商基因转录后的蛋白 翻译效率。因此以本专利技术所构建的载体在哺乳动物细胞中行进外源蛋白表达时，无需再于 编码基因中额外添加 ATG和Kozak序列，大大的简化了外源基因片段亚克隆至本载体的过 程。 3.本专利技术构建的新型表达载体pcDNA3. Ι-secreting,尽可能地保留了原载体的 pcDNA3. 1的多克隆位点区的限制性内切酶识别序列，方便外源基因片段的连接和插入。【附图说明】 图1为酶联免疫吸附法（ELISA)检测的原有pcDNA3. 1(+)载体和本专利技术中的 pcDNA3. Ι-secreting载体在HEK293细胞中表达重组人IL-6 (rhIL-6)蛋白片段的结果， 白框部分为细胞培养基中的rhIL-6含量，灰框部分为细胞破碎后细胞质中的rhIL-6含量。 由图可知，以pcDNA3. 1 (+)载体在HEK293细胞中表达的rhIL-6,基本分部于细胞质中，而培 养基中含量极低；而以本专利技术中构建的新型表达载体pcDNA3. Ι-secreting在HEK293细胞 中表达的rhIL-6,可以被有效的分泌到细胞培养基中，便于后续的分离与纯化。【具体实施方式】 实施例1 载体克隆表达区基因的制备，其具有序列表SEQ ID NO : 1中所不的喊基序列： (I) SEQ ID NO. 1的信息（参见序列表） (a)序列特征： *长度：72碱基对 *类型：核酸 *链型：双链 *拓扑结构：线性 (b)分子类型：寡聚核苷酸链 (C)假设：否 (d)反义：否 (e)最初来源：设计并人工合成 (2)载体克隆表达区基因的制备 1)载体克隆表达区基因的设计合成： 根据构建新型表达载体的预期目的，设计并合成两条寡聚核苷酸链：正向链P-F: 5 ' -GCTAGATGAGAGTTCCTCCTCAATTTCTGGGCTTGCTGCTTTTGTGGCTTCCCGGGGTGAGGTGC A-3,； 反向链 p-R: 5 ' -AGCTTGCACCTCACCCCGGGAAGCCACAAAAGCAGCAAGCCCAGAAATTGAGGAGGAACTCTCAT 2)寡聚核苷酸链的退火： IOX退火杂交缓冲液（SSC)成分：1. 5mol/LNaCl 0· 3M 柠檬酸三钠· 2H20， 以 HCl 调 pH 至 7. 0 退火反应体系： 10XSSC buffer 1 μ I 正反寡聚核苷酸链各5pmol 无菌超纯水 补齐体当前第1页1 2 本文档来自技高网...
【技术保护点】
载体克隆表达区基因，其特征在于：具有序列表SEQ ID NO：1中碱基序列。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：徐明恺，邹瑾，孟北乾，李旭，张惠文，
申请(专利权)人：中国科学院沈阳应用生态研究所，
类型：发明
国别省市：辽宁;21
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