本发明专利技术公开一种优化的表达载体，该载体是利用融合PCR技术，将pBBR1MCS系列广宿主克隆载体的骨架同表达载体pGEX4T‑1的启动子、调控序列LacIq以及终止序列相连，以替换pBBR1MCS质粒的lac启动子、LacZα编码序列和终止序列；同时，对该载体的多克隆位点进行了修饰，该位点包括了Xho I、Sma I、Spe I等酶切位点，还引入了Bgl II的酶切位点，便于基因的功能鉴定和克隆。将该载体转入大肠杆菌，可有效在该菌株中复制并表达外源蛋白，并且有利于外源蛋白的正确折叠，使其形成有活性的蛋白。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，涉及一种广宿主的表达载体的构建。
技术介绍
pBBR1MCS系列载体包括pBBR1MCS、pBBR1MCS2-5等一系列广宿主载体，这类载体可以在多种宿主中复制，像Acetobacterxylinum，Alcaligeneseutrophus，Bartonellabacilliformis，Bordetellaspp.，Brucellaspp.，Caulobactercrescentus，Escherichiacoli，Paracoccousdenitrificans，Pseudomonasfluorescens，Rhizobiummeliloti，Rhodobactersphaeroides，Vibriocholerae，Xanthomonascampestris等。这些载体的共同特征包括：(1)载体大小较小(﹤5.3kb)，可以插入的外源片段较大；(2)拥有一个扩展的多克隆位点(MCS)，(3)含有LacZα短肽编码基因，可以利用α互补直接筛选插入了外源片段的重组子，(4)可以与包括IncP,IncQ和IncW等在内的多种不兼容群的质粒兼容。但是，Sonja等人(2013)的研究发现，若利用pBBR1MCS系列载体表达外源基因，因为表达的外源蛋白的N端同β-半乳糖苷酶α端的大约20个短肽融合表达，可能会影响目的蛋白的活性。因此，若要将此系列载体应用于外源基因的表达，需要对其表达元件进行改造。
技术实现思路
本专利技术需要解决的问题是克服pBBR1MCS系列载体的缺陷，提供一种优化的pBBR1MCS系列载体，将该载体的LacZα短肽编码基因、lac启动子替换成来源于pGEX4T-1的tac启动子，使该载体更适用于基因的表达，目的基因可以用IPTG诱导表达且N端不含β-半乳糖苷酶α端的短肽，该载体的LacZα表达相关的终止序列可以被替换成pGEX4T-1的终止序列，也可以不用替换。本专利技术提供的优化的表达载体构建流程如下：利用PCR技术分别扩增来源于pGEX4T-1的包括Ptac启动子和调控序列LacIq的片段Ptac、终止序列Ter和来自pBBR1MCS系列载体的多克隆位点MCS，其中，MCS位点在设计引物时引入了BglII酶切位点；利用融合PCR技术将Ptac、Ter和MCS序列融合，获得表达元件PMT，在设计PMT片段引物时两端分别引入KpnI和SacI酶切位点；利用PCR扩增得到pBBR1MCS系列载体上除lac启动子、LacZα编码序列、MCS及终止序列以外的骨架结构pMCS，设计引物时PMCS两端分别引入KpnI和SacI酶切位点；利用KpnI和SacI对表达元件PMT和骨架结构pMCS进行酶切后利用Takara公司的连接试剂盒进行连接，获得改造的表达载体pBBRtac。同原有质粒相比，优化载体的多克隆位点引入了BglII的酶切位点，便于基因的克隆和功能鉴定。本专利技术构建的表达载体为pBBRtac系列载体，即pBBRtac，pBBRtac2-5。本专利技术构建的广宿主载体pBBRtac采用Ptac启动子，同Plac启动子相比，该启动子是trp启动子和lacUV5的拼接杂合启动子，转录水平更高，更有利于目的蛋白的表达，同时，去除了N端融合的20个左右氨基酸的β-半乳糖苷酶α端的短肽将有利于外源蛋白的正确折叠，使其形成有活性的蛋白，这非常有利于目标基因在多种宿主中的高效表达。本专利技术构建的广宿主载体已成功应用于大肠杆菌中。附图说明图1市售pBBR1MCS3质粒图谱图2pBBRtac3质粒图谱图3UgpG表达的SDS-PAGE分析具体实施方式实施例1pBBRtac3载体构建本专利技术以广宿主载体pBBR1MCS3为改造模板，将该载体的LacZα编码基因、lac启动子替换成来源于pGEX4T-1的tac启动子，使其适用于外源基因的表达，该载体的LacZα表达相关的终止序列可以被替换成pGEX4G-1的终止序列，也可以不用替换，本实施例中将pBBR1MCS3终止序列替换成pGEX4T-1的终止序列。同时，对该载体的多克隆位点进行改造，引入了BglII的酶切位点，得到重组质粒pBBRtac3。pBBRtac3的设计思路和技术路线如下：1.PCR扩增包含tac启动子和调控序列lacIq的片段Ptac以及终止序列Ter以质粒pGEX-4T-1(GenBankNo.U13853)为模板，根据基因的序列，利用primer5.0设计引物并扩增包含tac启动子和lacIq调控序列的片段Ptac以及终止序列Ter。设计引物序列为:Ptac-F：GATAACCGTATTACCGCCTTTG(SEQIDNO.1)Ptac-R：TCGACCTCGAGGGGGGGCCCACCTAGTATAGGGGACATGAA(SEQIDNO.2)Ter-F：GCCACCGCGGTGAGATCTATCTGCCTCGCGCGTTTCGGT(SEQIDNO.3)Ter-R：CGCGTTATTGAAGCATTTATCAGGGT(SEQIDNO.4)使用的酶是Takara公司高保真的HSDNAPolymerase，PCR反应条件为：95℃5min；95℃45s；50℃/55℃45s；72℃2.5min/30s，30个循环；72℃10min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳及测序验证。2.PCR扩增pBBR1MCS-3的多克隆位点MCS片段以pBBR1MCS-3为模板，以MCS-R和MCS-F为引物，利用购自Takara公司的HSDNAPolymerase，采用常规PCR方法扩增多克隆位点MCS片段，序列如SEQIDNO.7所示。在设计引物时去掉了原有的KpnI和SacI位点，引入了BglII的酶切位点(下划线部分)。测序结果表明，该多克隆位点既包含了原质粒上的的XhoI、SmaI、SpeI等酶切位点，同时也成功引入了酶切位点BglII。SEQIDNO.5：CAATTTCACACAGGAAACAGTACATATGGGGCCCCCCCTCGAGGTCGACGGTATCGATAAGCTTGATATCGAATTCCTGCAGCCCGGGGGATCCACTAGTTCTAGAGCGGCCGCCACCGCGGTGAGATCTATCTGCCTCGCGCGTTT设计引物如下：MCS-F：CAATTTCACACAGGAAACAGTACATATGGGGCCCCCCCTCGAGGTCGAC(SEQIDNO.6)MCS-R：AAACGCGCGAGGCAGATAGATCTCACCGCGGTGGCGGCCG(SEQIDNO.7)PCR反应条件：95℃5min；95℃45s；55℃45s；72℃30s，30个循环；72℃10min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳及测序验证。3.融合PCR构建表达元件PMT该过程通过两步来实现。第一步，融合PCR。在设计扩增Ptac、MCS和Ter片段的引物时，分别引入了同相邻片段重叠的序列，这些序列可以作为融合PCR的引物，并且，通过计算使PCR体系中各片段的摩尔浓度一致。PCR体系(25μL)为：2×GCBuffer12.5μL，dNTP2μL，HSDNAPolymerase0.4μL，MCS2.8μL，Ptac5.6μL，Ter本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种获得优化的表达载体pBBRtac的方法，其特征在于，改造pBBR1MCS系列载体，将所述pBBR1MCS系列载体的LacZα短肽编码基因、lac启动子替换成来源于pGEX4T‑1的Ptac启动子及其调控序列LacIq。
【技术特征摘要】
1.一种获得优化的表达载体pBBRtac的方法，其特征在于，改造pBBR1MCS系列载体，将所述pBBR1MCS系列载体的LacZα短肽编码基因、lac启动子替换成来源于pGEX4T-1的Ptac启动子及其调控序列LacIq。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，进一步将pBBR1MCS系列载体的终止序列替换为pGEX4T-1的终止序列。3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述表达载体通过如下步骤获得：1)利用PCR技术分别扩增来源于pGEX4T-1的包括Ptac启动子和调控序列LacIq片段Ptac、终止序列Ter和来自pBBR1MCS系列载体的多克隆位点MCS，其中，各片段设计引物时引入与相邻片段重叠的序列，MCS位点在设计引物时引入了BglII酶切位点；利用融合PCR技术，将Ptac、Ter和MCS序列融合，获得表达元件PMT；其中，在设计PMT片段引物时在两端引入KpnI和SacI酶切位点；2)...
【专利技术属性】
技术研发人员：李慧，朱虎，孙亚杰，焦学，周万龙，李菁，
申请(专利权)人：中国石油大学华东，
类型：发明
国别省市：山东;37
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。