戊二酸生物改进合成方法技术

一种戊二酸生物改进合成方法，通过在重组宿主大肠杆菌中表达2‐羟基戊二酸脱氢酶，戊烯二酰辅酶A转移酶，2‐羟基戊二酰辅酶A脱水酶，反‐烯酰辅酶A还原酶以及硫酯酶实现。通过对表达上述基因的重组大肠杆菌进行发酵生产，成功在发酵液中检测到目标产物戊二酸以及副产物戊烯二酸，2‐羟基戊二酸的生成。本发明专利技术所构建的生物合成途径为利用可再生资源合成戊二酸提供了一种新的方法。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及的是一种新的戊二酸合成途径、即经过2‐羟基戊二酸脱氢酶、戊烯二酸辅酶A转移酶、2‐羟基戊二酰辅酶脱水酶、烯酰辅酶A还原酶及酰基辅酶A硫酯酶的催化，将细胞内三羧酸循环的中间物α‐酮戊二酸转化成戊二酸，从而实现利用葡萄糖或者其它碳源发酵生产戊二酸的目的。具体涉及到编码这几种酶的基因的克隆、协同表达，以及重组大肠杆菌利用这些酶的催化功能发酵生产戊二酸的应用。
技术介绍
戊二酸是一种重要的化工原料，它可与不同长度碳链的二胺聚合成聚酰胺。作为工程塑料，聚酰胺具有优良的性能，被广泛应用于各个行业及领域。戊二酸作为聚酰胺的单体，具有很大的市场需求。工业上戊二酸主要从石油中加工提炼得到，以裂解碳五馏分中的环戊二烯为原料，部分加氢制成环戊烯，然后催化氧化环戊烯制备戊二酸(陈慧等人，石油化工，2006，35(2):118‐121)。但是由于石油资源的日益紧缺，人们希望开发出更多的利用可再生资源生产戊二酸的方法。Adkins等人报导了通过偶联赖氨酸合成及降解途径在大肠杆菌中利用葡萄糖生产戊二酸的方法，利用该途径，他们目前报道的产量及得率分别为0.82±0.03g/L、68±2mmol/mol(Adkins等人，BiotechnolBioeng，2013，110(6):1726‐1734)。此外，Djurdjevic等人报道了通过α‐酮戊二酸的还原途径生产戊烯二酸的方法。这个途径首先通过α‐羟基戊二酸脱氢酶HgdH将α‐酮戊二酸转化为2‐羟基戊二酸；戊烯二酸辅酶A转移酶GctAB将2‐羟基戊二酸转化为2‐羟基戊二酰辅酶A；另外，从共生梭菌(Clostridiumsymbiosum)中得到2‐羟基戊二酰辅酶A脱水酶HgdAB，从发酵氨基酸球菌(Acidaminococcusfermentans)中得到该脱水酶的激活因子HgdC，HgdABC可以将2‐羟基戊二酰辅酶A转化为戊烯二酰辅酶A。最后再通过戊烯二酸辅酶A转移酶GctAB将戊烯二酰辅酶A催化成为戊烯二酸(Djurdjevic等人，ApplEnvironMicrobiol，2011，77(1):320‐322)。戊烯二酸在α和β位不饱和，在工业上可被进一步利用化学催化的方法还原成戊二酸，但目前尚未有在细胞内直接将戊烯二酸转化成戊二酸的方法。另一方面，利用赖氨酸作为底物合成戊二酸时，每摩尔底物会释放一摩尔的二氧化碳，这样损失了对碳(糖)得率，而当α-酮戊二酸作为底物时则不会放出二氧化碳。因此α-酮戊二酸途径在理论上对糖得率更具优势。在之前的研究中发现，一种来源于眼虫藻Euglenagracilis的反‐2‐烯酰辅酶A还原酶Ter可催化2,3‐烯己二酰辅酶A还原成己二酰辅酶A(Yu等人，BiotechnolBioeng，2014，111(12):2580‐2586)。而戊二酸合成的前体2,3‐烯戊二酰辅酶A与2,3‐烯己二酰辅酶A结构类似，因此推测反‐2‐烯酰辅酶A还原酶Ter对其可能也具有催化活性。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术存在的上述不足，提出一种戊二酸生物改进合成方法，通过表达反‐2‐烯酰辅酶A还原酶Ter，可以实现从α‐酮戊二酸到戊二酸的转化。本专利技术是通过以下技术方案实现的：本专利技术涉及一种戊二酸生物改进合成方法，首先将编码α‐羟基戊二酸脱氢酶的hgdH、编码戊烯二酸辅酶A转移酶的gctAB、编码2‐羟基戊二酰辅酶A脱水酶的hgdABC、编码烯酰辅酶A还原酶的ter或编码酰基辅酶A硫酯酶中的至少一种或与其至少50％相似的同源序列中的至少一种在重组微生物内进行表达，然后将重组微生物培养并发酵得到戊二酸。所述的表达，具体步骤包括：1)将编码α‐羟基戊二酸脱氢酶的hgdH、编码戊烯二酸辅酶A转移酶的gctAB、编码2‐羟基戊二酰辅酶A脱水酶的hgdABC、编码烯酰辅酶A还原酶的ter或编码酰基辅酶A硫酯酶的tesB中的至少一种或与其至少50％相似的同源序列中的至少一种采用基于表达质粒的异源表达方式引入微生物宿主内实现自我复制，即设计引物序列，以相应菌株全基因组序列或全基因合成DNA为模板进行扩增，用内切酶酶切并连接到经同样内切酶酶切的表达质粒载体上；2)给予对应的启动子使得外源基因启动转录过程。所述的表达质粒为pTrc15C’及pZS*27MCS，其中：egter基因、hgdH基因、gctA基因和gctB基因在pTrc15C’质粒表达，hgdA基因、hgdB基因、hgdC基因和tesB基因在pZS*27MCS质粒表达。所述的微生物宿主包括作为表达宿主的大肠杆菌E.coliMG1655和作为克隆宿主的大肠杆菌E.coliDH5α。所述的重组微生物是指：E.coliMG1655重组大肠杆菌，其中同时带有pTrc15C’‐egTer‐HgdH‐GctAB质粒和pZS*27‐HgdABC‐TesB质粒。所述的培养，首先经过LB培养基活化，然后以初始接种量为OD600＝0.1接入到补充StandI培养基中，待细胞37℃培养至OD约为1.0时，加入100μMIPTG于30℃继续培养数天。所述的补充StandI培养基，具体为pH7.4的补充StandI培养基，其组分及含量为：15g/L牛肉蛋白胨，3g/L酵母提取物，50mM3‐(N‐吗啡啉)丙磺酸，3mML‐半胱氨酸，10mM谷氨酸钠，0.2mM核黄素，2mM柠檬酸铁。所述的培养，包括但不限于好氧、微氧以及厌氧培养。所述的发酵是指：当重组大肠杆菌在摄入营养物后，通过细胞内源的糖酵解途径以及部分三羧酸循环途径将营养物转化成α‐酮戊二酸，然后依次经：①通过重组微生物内进行表达的α‐羟基戊二酸脱氢酶HgdH的催化作用下，α‐酮戊二酸转化为2‐羟基戊二酸；②通过重组微生物进行表达的戊烯二酸辅酶A转移酶GctAB的催化作用下，2‐羟基戊二酸转化为2‐羟基戊二酰辅酶A；③通过重组微生物进行表达的2‐羟基戊二酰辅酶A脱水酶HgdABC的催化作用下，2‐羟基戊二酰辅酶A转化为2,3‐烯戊二酰辅酶A；④通过重组微生物进行表达的烯酰辅酶A还原酶Ter的催化作用下，一部分2,3‐烯戊二酰辅酶A转化为戊二酰辅酶A，其余2,3‐烯戊二酰辅酶A通过重组微生物进行表达的戊烯二酸辅酶A转移酶GctAB的催化作用下转化额外2,3‐烯‐戊二酸；⑤戊二酰辅酶A通过重组微生物进行表达的酰基辅酶A硫酯酶的经过催化水解转化为戊二酸。所述的营养物包括但不限于葡萄糖。所述的酰基辅酶A硫酯酶包括：通过重组微生物进行表达的酰基辅酶A硫酯酶TesB、酰基辅酶A硫酯酶YciA、酰基辅酶A硫酯酶TesA、酰基辅酶A硫酯酶AcoT7，其氨基酸序列依次如SeqIDNo.8～11所示。技术效果与现有技术相比，本专利技术本专利技术通过在大肠杆菌中以质粒的形式外源表达基于α‐酮戊二酸的戊二酸合成途径，包括2‐羟基戊二酸脱氢酶，戊烯二酸辅酶A转移酶，2‐羟基戊二酰辅酶脱水酶，脱水酶激活因子，反‐2‐烯酰辅酶A还原酶以及酰基辅酶A硫酯酶，使大肠杆菌成功发酵生产戊二酸。为利用可再生资源合成戊二酸提出了新的途径与方法。为今后进一步大规模生产戊二酸提供了潜力。附图说明图1为戊二酸合成途径示意图；图中：hgdH表示2‐羟基戊二酸脱氢酶的编码基因，gctAB表示戊烯二酸辅酶A转本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种戊二酸生物改进合成方法，其特征在于，首先将编码α‐羟基戊二酸脱氢酶的hgdH、编码戊烯二酸辅酶A转移酶的gctAB、编码2‐羟基戊二酰辅酶A脱水酶的hgdABC、编码烯酰辅酶A还原酶的ter或编码酰基辅酶A硫酯酶中的至少一种或与其至少50％相似的同源序列中的至少一种在重组微生物内进行表达，进而将重组微生物培养并发酵得到戊二酸。

【技术特征摘要】
1.一种戊二酸生物改进合成方法，其特征在于，首先将编码α‐羟基戊二酸脱氢酶的hgdH、编码戊烯二酸辅酶A转移酶的gctAB、编码2‐羟基戊二酰辅酶A脱水酶的hgdABC、编码烯酰辅酶A还原酶的ter或编码酰基辅酶A硫酯酶中的至少一种或与其至少50％相似的同源序列中的至少一种在重组微生物内进行表达，进而将重组微生物培养并发酵得到戊二酸。2.根据权利要求1所述的方法，其特征是，所述的表达，具体步骤包括：1)将编码α‐羟基戊二酸脱氢酶的hgdH、编码戊烯二酸辅酶A转移酶的gctAB、编码2‐羟基戊二酰辅酶A脱水酶的hgdABC、编码烯酰辅酶A还原酶的ter或编码酰基辅酶A硫酯酶的tesB中的至少一种或与其至少50％相似的同源序列中的至少一种采用基于表达质粒的异源表达方式引入微生物宿主内实现自我复制，即设计引物序列，以相应菌株全基因组序列或全基因合成DNA为模板进行扩增，用内切酶酶切并连接到经同样内切酶酶切的表达质粒载体上；2)给予对应的启动子使得外源基因启动转录过程。3.根据权利要求2所述的方法，其特征是，所述的表达质粒为pTrc15C’‐egTer‐HgdH‐GctAB及pZS*27‐HgdABC‐TesB，其中：egter基因、hgdH基因、gctA基因和gctB基因在pTrc15C’质粒表达，hgdA基因、hgdB基因、hgdC基因和tesB基因在pZS*27MCS质粒表达。4.根据权利要求2所述的方法，其特征是，所述的微生物宿主包括作为表达宿主的大肠杆菌E.coliMG1655和作为克隆宿主的大肠杆菌E.coliDH5α。5.根据权利要求2所述的方法，其特征是，所述的hgdH是来源于AcidaminococcusFermentans的2‐羟基戊二酸脱氢酶编码基因，hgdA和hgdB是来源于Clostridiumsymbiosum的2‐羟基戊二酰辅酶脱水酶的两个亚基编码基因，hgdC是来源于AcidaminococcusFermentans的脱水酶激活因子编码基因，gctA和gctB是来源于AcidaminococcusFermentans的戊烯二酸辅酶A转移酶的两个亚基编码基因，egter是来源于Euglenagracilis的反‐2‐烯酰辅酶A还原酶编码基因，tesB是来源于EscherichiacoliK12的酰基辅酶A硫酯酶编码基因，其氨基酸序列依次如SeqIDNo.1～8所示。6.根据权利要求2所述的方法，其特征是，所述的引物序列包括：egter‐上游引物，如SeqIDNo.12所示，具体为：5’‐tctgccatggcgcatatggcgatgtttaccacgaccgc‐3’；egter‐下游引物，如SeqIDNo.13所示，具体为：5’‐atctggtaccttattgctgcgcggcgctcg‐3’；hgdH‐上游引物，如SeqIDNo.14所示，具体为：5’‐atctggtaccattacaggagaagcctgatgaaagtgctgtgctacgg‐3’；hgdH‐下游引物，如SeqIDNo.15所示，具体为：5’‐cgtcggatccgtctgcggccgcttatttaattttattaggac‐3’；gctAB-上游引物，如SeqIDNo.16所示，具体为：5’‐actcggatccattacaggagaagcctgatgagcaaagttatgaccc‐3’；gctAB...

【专利技术属性】
技术研发人员：钱志刚，於佳乐，夏小霞，钟建江，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：上海;31