一种生物转化法合成α-酮戊二酸的方法技术

本发明专利技术目提供一种生物转化法合成α-酮戊二酸的方法，所述方法以L-谷氨酸为底物，于马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)ATCC36534经转化培养基培养获得的转化培养液中，加入α-酮戊二酸脱氢酶抑制剂，在25～30℃、200～250r/min振荡条件下进行合成转化培养，合成转化培养结束后，合成转化液经分离纯化得到所述的α-酮戊二酸；生长状态的酵母细胞将L-谷氨酸转化为α-酮戊二酸，加入α-酮戊二酸脱氢酶抑制剂，阻断了其被进一步代谢消耗，从而α-酮戊二酸在培养基中大量积累；在底物L-谷氨酸投料浓度为50g/L时，摩尔转化率可达83.2％；本发明专利技术把低价值的L-谷氨酸转化高价值的α-酮戊二酸，可大规模工业化应用，生产工艺具有周期短、转化率高和环境污染小等优点。

【技术实现步骤摘要】
一种生物转化法合成α-酮戊二酸的方法(一)
本专利技术属于生物化工
，具体地说，是关于一种生物转化法合成α-酮戊二酸的方法。(二)
技术介绍
α-酮戊二酸(α-ketoglutaricacid)，又名α-羰基戊二酸、2-氧代戊二酸或α-胶酮酸，CAS号为328-50-7。α-酮戊二酸是三羧酸(TCA)循环中重要的中间产物之一，在细胞物质代谢和能量代谢中起着重要的作用。它作为重要的中间体，是合成多种氨基酸、维生素的重要前体。α-酮戊二酸在医药、有机合成、营养强化剂等领域有着重要的应用前景，目前其主要应用的领域有：作为运动功能饮料的成分、有机合成中的中间体、肝功能检测的配套试剂和体格增强剂；降低术后患者和长期病人的机体损耗；还有研究表明，α-酮戊二酸具有抗氰作用，与亚硝酸钠、硫代硫酸钠配合使用可提高抗氰能力，具有抗惊厥作用。目前α-酮戊二酸的生产工艺主要是化学合成法。化学合成法以琥珀酸和草酸二乙酯为原料经化学反应制备，由于成本过高、污染严重而面临被淘汰。α-酮戊二酸的生产也可以采用生物发酵法或生物转化法，相对于化学合成法，生物法具有生产条件温和、工艺步骤简单、对环境友好等优点。近些年来，生物法合成α-酮戊二酸的研究取得了很大进展，发酵单位或转化率有大幅度提高，但生产成本仍高于化学合成法，工业化应用尚有一定困难。近几年来国内关于生物法合成α-酮戊二酸有较多研究报道，并申请了一些专利。如江南大学的陈坚等人利用重组解脂耶氏酵母菌(Yarrowialipolytica)发酵生产α-酮戊二酸，发酵144h，α-酮戊二酸的产量达到47.2g/L(中国专利技术专利ZL201210066444.6)；天津科技大学的陈宁等人利用对谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)发酵生产α-酮戊二酸，发酵32h，α-酮戊二酸产量最高可达47.2g/L(中国专利技术专利ZL201110392778.8)。但是，发酵法也有其缺点，如生产周期长，产品与发酵液中多种成分混合在一起，导致提取与精制工艺复杂，总成本偏高。而生物转化法或许能克服发酵法的缺陷，可以提高产品浓度、简化提取工艺、降低成本。如陶荣盛等人采用L-谷氨酸氧化酶对L-谷氨酸或其盐进行生物转化，生成α-酮戊二酸的浓度可高达138.5g/L，摩尔得率达80％以上(中国专利技术专利申请号201310134674.6)。但该专利技术需要制备L-谷氨酸氧化酶，而且在催化反应时需要添加商品过氧化氢酶，所以生产中酶的成本较高。江南大学的陈坚等人还报道了一种采用全细胞转化L-谷氨酸生产α-酮戊二酸的方法，通过易错PCR或定点饱和突变改造L-氨基酸脱氨酶基因，在枯草芽孢杆菌表达后转化L-谷氨酸生成α-酮戊二酸，摩尔得率可达85％以上，但底物浓度仅为15g/L，产量有待提高。(三)
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种利用马克斯克鲁维酵母(Kluyveromycesmarxianus)ATCC36534全细胞生物转化L-谷氨酸合成α-酮戊二酸的方法，以酵母细胞为生物催化剂，L-谷氨酸为原料，全细胞法生物转化合成α-酮戊二酸。在高糖低氮培养基中，添加脱氢酶抑制剂，阻止α-酮戊二酸被进一步代谢，从而促进α-酮戊二酸的积累，如此就可以将廉价的L-谷氨酸转化为价格更高的α-酮戊二酸，解决了目前发酵法、酶法和全细胞转化法生产成本较高的问题，具有较高的工业化应用价值。本专利技术全细胞法生物转化合成α-酮戊二酸反应式：本专利技术采用的技术方案是：本专利技术提供一种生物转化法合成α-酮戊二酸的方法，所述方法以L-谷氨酸为底物，于马克斯克鲁维酵母(Kluyveromycesmarxianus)ATCC36534经转化培养基培养获得的转化培养液中，加入α-酮戊二酸脱氢酶抑制剂，在25～30℃、200～250r/min振荡条件下进行合成培养，合成培养结束后，合成培养液经分离纯化得到所述的α-酮戊二酸；所述α-酮戊二酸脱氢酶抑制剂为过氧化氢(H2O2)或甲氨蝶呤中的一种或两种的混合；所述转化培养基的组成为(试剂均为市售分析纯或生物试剂)：蔗糖50～100g/L，酵母浸出粉10～20g/L，KH2PO43～5g/L，K2HPO45～6.5g/L，MgSO40.5～1.0g/L，溶剂为水，pH值自然。进一步，所述的底物在转化培养液中的添加量为20～50g/L。所述的底物L-谷氨酸(CAS:56-86-0)为市售原料，纯度≥98％。进一步，所述的α-酮戊二酸脱氢酶抑制剂添加量以转化培养液体积计为0.0005～50mmol/L。所述的α-酮戊二酸脱氢酶抑制剂为H2O2时，所述H2O2以质量浓度30％的H2O2水溶液的形式加入，H2O2水溶液中H2O2的加入量以转化培养液体积计为10～50mmol/L。所述的α-酮戊二酸脱氢酶抑制剂为甲氨蝶呤时，所述甲氨蝶呤以1mmol/L的甲氨蝶呤水溶液的形式加入，所述甲氨蝶呤水溶液中甲氨蝶呤加入量以转化培养液体积计为0.5～1μmol/L。所述的α-酮戊二酸脱氢酶抑制剂为H2O2和甲氨蝶呤的混合时，所述H2O2以质量浓度30％的H2O2水溶液的形式加入，H2O2水溶液中H2O2的加入量以转化培养液体积计为40mmol/L，所述甲氨蝶呤以1mmol/L的甲氨蝶呤水溶液的形式加入，所述甲氨蝶呤水溶液中甲氨蝶呤加入量以转化培养液体积计为0.8μmol/L。所述的α-酮戊二酸脱氢酶抑制剂的作用是抑制α-酮戊二酸脱氢酶的活性，阻断α-酮戊二酸进一步的代谢，从而α-酮戊二酸得以积累。本专利技术所述马克斯克鲁维酵母ATCC36534以干菌体浓度6～10g/L的转化液形式与底物进行转化反应，所述转化液是将马克斯克鲁维酵母ATCC36534斜面菌体接种至转化培养基或将干菌体浓度5～7g/L的种子液以体积百分数5-10％的接种量接种至转化培养基经转化培养获得的。具体的，本专利技术所述生物转化法合成α-酮戊二酸的步骤如下：(1)将冰箱保存的马克斯克鲁维酵母ATCC36534的菌体接种于新鲜斜面培养基，于25～30℃恒温培养箱中培养24～36h，得到活化后的马克斯克鲁维酵母ATCC36534菌种。所述的斜面培养基组成为：葡萄糖10～20g/L，蛋白胨5～10g/L，酵母浸出粉3～5g/L，琼脂15～20g/L，溶剂为水，pH自然(实测6.3～6.5)，高压蒸汽121℃灭菌15～20min。(2)用接种环挑取步骤(1)活化培养后马克斯克鲁维酵母ATCC36534斜面菌体2～3环，接种至种子培养基。接种后的种子培养基于25～30℃、200～250r/min振荡条件下培养20～24h，得干菌体浓度为5～7g/L的种子液。所述的种子培养基组成除不加琼脂外，其他成分同步骤(1)中的斜面培养基，在三角瓶中的装量为其容积的20％～40％，三角瓶8层扎口，高压蒸汽121℃灭菌15～20min。(3)用接种环挑取步骤(1)活化培养后马克斯克鲁维酵母ATCC36534斜面菌体3～5环，或步骤(2)制备的种子液，按体积百分数5％～10％的量接入转化培养基，于25～30℃、200～250r/min振荡条件下培养20～24h，获得干菌体浓度为6～10g/L，加入终浓度为10～50mmol/L的H2O2，或终浓度为0.5～1.0μmol/L的甲本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种生物转化法合成α‑酮戊二酸的方法，其特征在于所述方法以马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)ATCC36534为催化剂，以L‑谷氨酸为底物，于马克斯克鲁维酵母ATCC36534经转化培养基培养获得的转化培养液中，加入α‑酮戊二酸脱氢酶抑制剂，在25～30℃、200～250r/min振荡条件下进行合成培养，合成培养结束后，合成培养液经分离纯化得到所述的α‑酮戊二酸；所述α‑酮戊二酸脱氢酶抑制剂为过氧化氢或甲氨蝶呤中的一种或两种的混合；所述转化培养基的组成为：蔗糖50～100g/L、酵母浸出粉10～20g/L，KH2PO4 3～5g/L，K2HPO4 5～6.5g/L，MgSO4 0.5～1.0g/L，溶剂为水，pH自然。

【技术特征摘要】
1.一种生物转化法合成α-酮戊二酸的方法，其特征在于所述方法以马克斯克鲁维酵母(Kluyveromycesmarxianus)ATCC36534为催化剂，以L-谷氨酸为底物，于马克斯克鲁维酵母ATCC36534经转化培养基培养获得的转化培养液中，加入α-酮戊二酸脱氢酶抑制剂，在25～30℃、200～250r/min振荡条件下进行转化培养，转化培养结束后，转化培养液经分离纯化得到所述的α-酮戊二酸；所述的底物L-谷氨酸在转化培养液中的添加量为50g/L；所述α-酮戊二酸脱氢酶抑制剂为过氧化氢或甲氨蝶呤中的一种或两种的混合，所述过氧化氢以质量浓度30％的过氧化氢水溶液的形式加入，过氧化氢水溶液中过氧化氢的加入量以转化培养液体积计为40mmol/L；所述甲氨蝶呤以1mmol/L甲氨蝶呤水溶液的形式加入，所述甲氨蝶呤水溶液中甲氨蝶呤加入量以转化培养液体积计为0.8μmol/L；所述转化培养基的组成为：蔗糖100g/L、酵母浸出粉20g/L，KH2PO45g/L，K2HPO46.5g/L，MgSO41.0g/L，溶剂为水，pH自然。2.如权利要求1所述生物转化法合成α-酮戊二酸的方法，其特征在于所述马克斯克鲁维酵母ATCC36534以干菌体浓度6～10g/L的转化培养液形式与底物进行转化反应，所述转化培养液是将马克斯克鲁维酵母ATCC36534斜面菌体接种至转化培养基或将干菌体浓度5～7g/L种子液以体积百分数5-10％的接种量接种至转化培养基经转化培养获得的。3.如权利要求1所述生物转化法合成α-酮戊二酸的方法，其特征在于所述方法按如下步骤进行：(1)将马克斯克鲁维酵母ATCC36534的菌体接种于新鲜斜面培养基，于25～30℃恒温培养箱中培养24～36h，得到活化后的马克斯克鲁维...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈虹，陈蔚青，张建芬，柯薇，陆胤，梅建凤，
申请(专利权)人：浙江树人大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33